3-Ma’ruza: Oqsillar va peptidlarning biologik funktsiyasi
N-oxirgi amnokislota tarkibni aniqlash
Download 1.64 Mb. Pdf ko'rish
|
3-maruza
|
N-oxirgi amnokislota tarkibni aniqlash.Oqsildagi polipeptid zanjirda
bir tomonda erkin -aminoguruhga ega (amino yoki oxirgi), ikkinchi tomondan erkin -karboksil (karboksil yoki oxirgi) guruhga ega aminokislota qoldig’i mavjud.Oxirgi aminokislota qoldiqlarini aniqlash oqsil aminokislota ketma-ketligini aniqlash jaryonida muhim ahamiyatga egadir.Izlanishning birinchi bosqichida bu oqsil molekulasini tashkil etuvchi polipeptid zanjirlari sonini va tekshirilayotgan namunani gomogen darajasini aniqlashga imkon beradi.Keyingi bosqichlarda -oxirgi aminokislotalarni tekshirish orqali peptid fragmentlarini bo’linish darajasini nazorat qilishga imkon beradi. -oxirgi aminokislota qoldiqlarini aniqlashni birinchilardin bo’lib,1945 yilda ingliz biokimyogari Frederick Sanger tomonidan tavsiya etilgan edi.U polipeptid zanjirlarida -uchki aminokislotani,xususan insulinda aniqlash uchun foydalanishni tavsifladi.F.Sangerning dastlabki natijalari shuni ko'rsatdiki,insulin oldindan hisoblangandan ko’ra kichikroq molekuladir (molekulyar massasi 12000) va to'rt zanjirdan iborat (ikkitasi glitsin bilan va ikkitasi fenilalanin bilan tugaydi) va zanjirlar disulfid bog’lari bilan bog'langan.F.Sanger boshqa usullar bilan birgalikda dinitroftorbenzolni(3.7-rasm) qo'llagan holda insulin ustida ishlashni davom ettirdi va natijada insulinni ketma-ketligi to'liq aniqlandi (molekulyar massasi taxminan 6000 ga teng ikkita zanjirdan iborat). 3.7-rasm.2,4-Dinitroftorbenzolning kimyoviy va shar-sterjen tuzilishi. F.Sangerning reaktiv haqidagi dastlabki tadqiqot natijalaridan so'ng, oqsillarni o'rganish uchun dinitroftorobenzol usuli keng qo'llanilib, keynchalik u uchki tahlil uchun boshqa reagentlar(masalan,dansil xlorid va keyinchalik aminopeptidazalar va karboksipeptidazalar) va ketma- ketlikni aniqlashning boshqa umumiy usullari (masalan, Edman)degradatsiyasi) bilan almashtirildi.Dinitroftorbenzol aminokislotalardagi amin guruhi bilan reaktsiyaga kirishib,dinitrofenilaminokislotalarni hosil qiladi(3.8-rasm). Ushbu DNF-aminokislotalar peptid bog’larini parchalaydigan kislotali gidroliz sharoitida o'rtacha darajada barqarordir. Keyin DNF- aminokislotalarni ajratib olish mumkin va bu aminokislotalarni xromatografiya usuli orqali aniqlash mumkin.So'nggi paytlarda Sanger reaktivi, shuningdek HPLC bilan birgalikda biologik tizimlardagi glutation va sisteinning qaytarilgan va oksidlangan shakllarini ajratish uchun juda qiyin tahlil qilish uchun ishlatilgan. 3.8-rasm.Dinitrofenilaminokislotalarni hosil bo’lishi. Ushbu usul shu qadar mustahkamki, uni qon yoki hujayra lizati kabi murakkab matritsalarda bajarish mumkin.Oqsil yoki peptidni 2,4- dinitroftorbenzol bilan ta’siri natijasida sariq rangga bo’yalgan dinitrofenil ( ) hosila hosil bo’ladi.Kislotali gidroliz (5.7n. ) natijasida hosilani polipeptid zanjir bilan bog’lab turgan peptid bog’lari uzilib, oxirgi aminokislotani hosilasi hosil bo’ladi. aminokislota efir bilan ekstraktsiya qilinadi va standartlar ishtirokisda yupqa qatlamli xromatografiya usuli bilan qiyoslanib, o’xshashligi aniqlanadi.Jarayon umumiy holatda quyidagicha tasvirlanadi: Shu bilan bir qatorda biritaniyalik biokimyogarlar Brian Selby Hartley va V.Grey tomonidan 1963 yilda yaratilgan dansil usuli ham keng qo’llanilmoqda.Dansil xlorid yoki 5-(dimetilamino) naftalin-1-sulfonil xlorid (3.9-rasm) alifatik va aromatik aminlarning birlamchi aminoguruhlari bilan barqaror ko'k yoki ko'k-yashil flüoressirlovchi sulfonamidli birikmalar hosil qilish bilan reaksiyaga kirishadi.Uni ikkilamchi aminlar bilan ham reaktsiyaga kiritish mumkin.Dansil xlorid aminokislotalarni o'zgartirish(modifikatsiya) uchun ham keng qo'llaniladi; xususan, oqsillar ketma-ketligi va aminokislotalarni tahlil qilish.Dansil xlorid DNSC ko’rinishida belgilanishi mumkin.Bundan tashqari,ushbu oqsil-DNSC konyugatlari bevosita atrof muhitga sezgir.Bu triptofan aminokislotasidan energiya olish qobiliyatini (fluoressensiya rezonans energiyasini uzatishdagi kabi) kombinatsiyalashgan holda, ushbu nishonlash usulidan oqsillarning qayilishi va dinamikasini o'rganishda foydalanish imkonini beradi. 3.9-rasm.5-(dimetilamino) naftalin-1-sulfonil xloridning kimyoviy va shar-sterjen tuzilishi. Ushbu sulfonilamid birikmalarining fluoressensirlovchi ta'sirini - siklodekstrin qo'shib yaxshilash mumkin. Dansil xlorid dimetilsulfoksidda beqaror bo'lib, uni reagent eritmalarini tayyorlash uchun ishlatmaslik kerak.Dansil hosilalarining ekstinksiya koeffitsienti ularning eritmadagi konsentratsiyasini o'lchash uchun muhimdir.Dansil xlorid eng oddiy sulfanilamidning hosilalaridan biridir, shuning uchun u odatda boshqa hosilalarni ishlab chiqarish uchun boshlang'ich reagent sifatida xizmat qiladi.Dinitrofenil usuli kabi bu usul ham oqsil aminoguruhiga gidroliz natijasida uzilmaydigan“nishon” kiritishga asoslangan.Uning birinchi bosqichida dansilxlorid (1- dimetilaminonaftalin-5-sulfoxlorid) oqsil yoki peptidning protonlanmagan -aminoguruhi bilan ta’sirlashib, dansil-peptid (DNS- peptid) hosil qiladi(3.10-rasm). Keyingi bosqichda DNS-peptid gidrolizlanib (5.7n.HCl,105 0 C ,12-16 soat) N-oxirgi -DNS- aminokislota ajratib olinadi. Shu bilan bir qatorda lizin va tirozinning yon zanjirlarini dansillash natijasida DNS -lizin va DNS -tirozin hosil bo’ladi. DNS -aminokislotalar spektrni ultrabinafsha qismida ( qo’zg’ =365nm) intensiv fluorestsentsiyaga egadirlar;ularni qiyoslab, o’xshashliligini anqlash uchun 0.1-0.5 nanomol modda yetarli. (CH 3 ) 2 N SO 2 Cl H 2 N-CH-CONHCH-COOH R R + (CH 3 ) 2 N SO 2 HN-CH-CONHCH-COOH R R (CH 3 ) 2 N SO 2 HN-CH-COOH + H 2 N-CH-COOH R R 3.10-rasm. Dansil hosilalarining hosil bo’lishi. Dansil usulidan foydalanishni ba’zi cheklanishlari yetarli darajada qattiq sharoitdagi gidroliz bilan bog’liqdir.Bunda triptofan qoldiqlari parchalanadi va asparagin va glutaminni dezaminlanishi sodir bo’ladi.Shu bilan bir qatorda - - - - - -va boshqalar gidrolizga bardoshdir, buning natijasida -aminokislotalar bilan bir qatorda -peptidlar hosil bo’ladi.Bu esa ularni qiyoslab, o’xshashligini aniqlash uchun qiyinchilik tug’diradi.Shuning uchun bunday holatda gidroliz vaqti 2-3 sutkagacha uzaytiriladi.Ikkinchi tomondan o’zgaruvchan - , - va - ni unumini oshirish uchun gidroliz vaqtini 4 soatgacha kamaytirish lozim. Uzoqvaqtlar davomida -aminokislotalarni qiyoslab,o’xshashligini aniqlash uchun mikroyupqa qatlamli xromatografiya usulidan foydalanilgan. -aminokislotalarni bo’lish uchun sellyuloza, silikagel va poliamidning yupqa qatlamidagi bir va ikki o’lchamli xromatografiya uchun turli sistemalar taklif etildi.Ammo -aminokislotalarni aniqlash uchun eng istiqbolli usullardan biri yuqorisamarali qaytarfazali suyuqlik xromatografiyasi hisoblanadi.Fluoresent detektordan foydalanish natijasida dansil usulini sezgirligi 10 pikomolgacha oshiriladi.Shu bilan bir qatorda -oxirgi aminokislotalarni Edman va aminopeptidazalar bilan fermentli gidroliz usullari bilan aniqlash mumkin. Download 1.64 Mb. Do'stlaringiz bilan baham: 
|