3-Ma’ruza: Oqsillar va peptidlarning biologik funktsiyasi
Download 1.64 Mb. Pdf ko'rish
|
3-maruza
|
7.Affin xromatografiyasi yoki moyillik asosidagi xromatografiya.Bu
oqsillarning qattiq tashuvchiga biriktirilgan (immobilizatsiya qilingan) ligandlar bilan tanlab o'zaro ta'siriga asoslangan individual oqsillarni ajratib olishning eng o'ziga xos usulidir(3.4-rasm).Agar biron bir ferment, antitelani ajratish uchun antigenlar va boshqalar ajratib olinayotgan bo'lsa,ligand sifatida substrat yoki koenzimdan foydalanish mumkin.Oqsil aralashmasini o'z ichiga olgan eritma immobilizatsiya qilingan ligand bilan to'ldirilgan kolonka orqali o'tadi.Faqatgina u bilan o'zaro ta'sir qiladigan oqsil ligandga birikadi; boshqa barcha oqsillar elyuat bilan chiqadi.Kolonkaga adsorbilangan oqsilni qiymati yoki o'zgargan ion kuchiga egabo’lgan bilan eritma bilan yuvish orqali olib tashlash mumkin.Ba'zi hollarda oqsil va ligand o'rtasidagi gidrofob bog’larni buzish uchun detergent eritmasi ishlatiladi.Affin xromatografiyasi juda selektivdir va ajratilgan oqsilni minglab marta tozalashga yordam beradi. 3.4-rasm.Affin xromatografiya. 1-o’rganilishi lozim bo’lgan oqsil;2-ligand;3-polimer asosga birikkan ligand;4-ligand eirtmasi;5-proteinlar aralashmasi;6-o’rganilishi lozim bo’lgan oqsilni bog’lovchi spetsifik ligandga ega bo’lgan polimer tashuvchili kolonkaga oqsil aralashmasini quyish;7-zarur bo’lmagan oqsillar aralashmasi;8-o’rganilishi lozim bo’lgan oqsil ligand eritmasi bilan yuvilmoqda. 8.Dializ.Dializ quyi molekulyar qo’shimchlardan aralashmalarni ajratish yoki muhitning tarkibini almashtirish uchun ishlatiladi.Usul oqsil molekulalarining kattaligi tufayli yarimo'tkazuvchi membranalardan o'tolmasligiga asoslanadi,past molekulyar moddalar membrana bilan atrofdagi hajm o'rtasida teng taqsimlanadi(3.5-rasm).Tashqi eritmani takroran almashtirishdan so'ng,dializ xaltasidagi muhitning tarkibi (tuz konsentratsiyasi, va boshqalar) atrofdagi eritmada bo'lgani kabi bo'ladi. 3.5-rasm.Dializ:dializni boshlanishi(chap) va muvozanat holati(o’ng). 1-membrana;2-erituvchi;3-konsentrlangan eirtma. Oqsil va peptidlarning aminoksilota tarkibini aniqlash uchun tekshirilayotgan manba 5.7n.xlorid kislotada gidroliz qilinadi va gidrolizatdagi barcha aminokislotalarni miqdori aniqlanadi.Namuna gidrolizi vakuumda kavsharlangan ampulada da 24 soat davomida amalga oshiriladi.Bunda triptofan to’liq;serin, treonin,sistin va sistein qisman parchalanadilar, glutamin va asparagin esa tegishli asparagin va glutamin kislotalargacha to’liq parchalanadi.Shu bilan birga tarmoqlangan yon zanjirli aminokislotalardan( ) hosil bo’lgan peptid bog’lari fazoviy to’sqinliklar natijasida qisman gidrolizlanadi.Ayniqsa - - - - bog’lari barqarordir.Oqsilni aminokislota tarkibini juda to’g’ri aniqlash uchun 24,48,72 va 96 soat davomida parallel ravishda gidroliz amalga oshiriladi va barcha namunalar tekshiriladi. Oqsildagi triptofan miqdorini aniqlash uchun gidrolizda xlorid kislota o’rniga 4n.metansulfokislota olinadi.Triptofanni spektrofotometrik yoki rangli reaksiyalar yordamida aniqlash mumkin.Odatda oqsilni aminokislota tarkibini aniqlashda glutamin va glutamin kislota, asparagin va asparagin kislotani umumiy miqdori aniqlanib,ularni differentsiatsiyasi birlamchi tuzilishni aniqlash jarayonida amalga oshiriladi.Oqsil gidrolizatidagi aminokislotalarni miqdoriy aniqlash aminokislota analizatori qurilmasi orqali amalga oshiriladi(3.6-rasm).Aminokislota analizatori 1958 yilda amerikalik biokimyogarlar Stanford Moore va William Howard Stein tomonidan yaratilgan.Aminokislotalar aralashmasi sulfirlangan polistirol smolasi bilan to’ldirilgan kolonkada ionalmashinish xromatografiyasi orqali amalga oshiriladi.Kolonka bufer eritmalari bilan asta-sekin ularni va konsentrasiyasini oshirilib yuviladi.Har bir aminokislotani ushlanish vaqti aniqlangan bo’lib, uni ionlanish darajasiga bog’liqdir.Kolonkadan chiqayotgan elyuat ningidrin eritmasi bilan aralashtiriladi va maxsus bo’lmachada gacha qizdiriladi. Aminokislota ningidrin bilan ta’sirlashib, ammiak, karbonat angidrid va aldegid hosil qiladi.Hosil bo’lgan ammiak ningidrinni boshqa molekulasi bilan ta’sirlashib,570 nm da yutilish maksimumiga ega binafsha rangli hosila hosil qiladi.Prolin ningidrin bilan ta’sirlashib,440nm da maksimumga ega sariq rangli mahsulot hosil qiladi.Reaksiya natijasida hosil bo’layotgan mahsulotlar intensivligi tekshirilayotgan gidrolizatdagi aminokislotalar miqdoriga proportsional bo’lib,spektrofotometr yordamida aniqlanadi.Zamonaviy aminokislota analizatorlarida 1 nanomol aminokislota ishonchli aniqlanadi, tekshirish vaqti 1.5-2 soatni tashkil etib, barcha jarayon avtomatlashtirilgan.Ba’zi analizatorlarda sezgirlikni oshirish uchun aminokislotalar bilan ta’sirlashayotganda fluorestsirlovchi birikmalar hosil qiluvchi fluoreskamin yoki o-ftal angidrid qo’llanadi. Bunday holatlarda maxsus detektor qo’llab 10-50 pikamol aminokislotani aniqlash mumkin. 3.6-rasm.Aminokislota analizatori(MODEL S433 (SYKAM )). Download 1.64 Mb. Do'stlaringiz bilan baham: 
|