Аффин хромотографияси

1.1 Юқори специфик ва гурухли спецификликка эга
бўлган сорбентлар.

Агарда бирикма специфик ва кайтар тарзда боғланса ушбу бирикма биолагик фаол моддани ажратиш учун мос келувчи аффин лиганд хисобланади. Модомики, биологик фаол моддаларнинг табииати ҳар хил экан бунга мувофик равищда қўлланиладиган аффин лигандлар турли хилдаги бирикмаларни вакиллари бўлиши мумкин. Шунинг учун уларнинг класификациясини кимёвий структураси эмас балки, биокимёвий функциялари ( ёки вазифалари) асосида бажариш максадга мувофиқдир.

Ферментлар ингибиторлар, кофакторлар, антителалар, антигенлар, аглютенинлар, гликопротеинлар ва гиликополисахаридлар, нуклеин кислоталар, нуклиотедлар ва уларнинг рицепторлари, липидлар хужайралар, вируслар ва бошка моддаларни ажратиш учун қўлланиладиган аффин лигандлар мавжудддир. Ушбу лигандлар жуда тор спецификликка эга бўлган аффин лигандлар ҳисобланади . Агар битта фермент учун специфик бўлган тагшувчига ингибитор бириктириб қўйилса хосил бўлган сарбент фақат ушбу фермент учун специфик бўлади. Бироқ, специфик лигандни қўллаш учун хар бир ажралиш жараёни учун турли хил ва кўпинча жуда муракаб бўлган сорбент синтизини ўтказиш лозим.
Бироқ специфик лигантни қўллаш учун хар бир ажратишлар учун сорбентларнинг турли хил кўп холларда жуда мураккаб кечадиган синтезни ўтказиш зарур. Аффинантларнинг хаммаси хам макромолекулаларнинг эримайдиган ташувчига комплементар боғланиш учун мос келадиган функционал гурухларга эга эмас. Ушбу гурухлар аффил лигандга аввалдан киритилган бўлиши шарт.
Мос келувчи узунликдаги фазовий “оёқга” каби ушбу гурухлар хам молекуляр аффин лигандлар учун зарурдир( улар сорбцияланаётган модда билан специфик (ўзига хос) ўзаро таъсирлашувни амалга оширишга ёрдам беради). Специфик сорбентларни тайёрлашда тор специфик лигандлар ўрнига айтайлик, “умумий лиганд” лардан фойдаланилса, уларнинг амалий фойдаси бир неча бор ошади. Аниқ кўриниб турибдики, умумий лиганд тутган, гуруҳли спецификликка эга бўлган матрица, биологик макромолекулаларнинг катта гуруҳига нисбатан аффинликни намоён этади. Масалан, аспарагин кислотаси метаболизми ферментларнинг IV-( ω -аминогексил) α -аспартат-сефарозасида гуруҳли специфик сорбцияси аниқланган. Шундай иммобилланган аффин лигандда тетранитрометан билан модификацияланган аспарагиназа, аспартаза, аспартат- β -декарбоксилаза ва аспарагиназалар сорбцияниши мумкин.
Гуруҳли спецификликка эга бўлган аффин лигандлар учун ҳар бир индивидуал фермент иммобилланган лиганднинг фақатгина бир қисмини фарқламайди ва у билан бир хил усулда ўзаро таъсирлашади. Масалан, бир нечта ферментлар учун умумий бўлган ёки турли усуллар билан иммобилланиши мумкин бўлса, у холда аффин xромотография кўрсаткичлари аффин лиганд билан бириккан хар бир индивидуал ферментни ўзаро таъсирлашиш табиатини тушунишга ёрдам беради.
Сефарозага бириккан 5¹ - АМР да қатор дигедрогеназа ва кеназаларнинг фермент билан ўзаро таъсирлашиши учун аффин лиганднинг ёки аденозин қисми, ёки эркин фосфат гурухи очиқ бўлиши керак. Нуклеотиднинг фосфат гурухи бўғланишда мухим роль ўйнайди. Масалан, алкоголдегидрогеназа ёки глицериназаларни бўғлашда; аксинча нуклеотидларни миокеназа ёки глицериназадегид-3-фосфатдегидрогеназа билан ўзаро таъсирланишидан сўнг бу ролни лиганднинг аденазинли қисми бажаради.
Аффин xроматографияда умумий лигандларни қўллашда жиддий чекланиш бўлиб, уларни хусусиятига кўра танланиши хисобланади. Шунинг учун сублиматланувчи феррментларнинг мураккаб аралашмасини ажратиш учун бир қатор ўзига хос воситалар зарур.
Агарда иммобилланган аффин лиганд бир неча комплементар лигандга нисбатан ўxшашлиги аниқланса, бу ҳолат адсорбция изомериясининг спецификлик шаклида акс этади. 4 та фермент учун адсорбция изомериясига мисол тариқасида, уларнинг ҳар бирида иммобилланган аффин лигандга нисбатан индивидуал ўxшашлик аниқланган. Биринчи фермент диссосация константаси 10^-7 - 10^-8моль/литр бўлган специфик сорбентга нисбатан жуда юқори ўxшашликка эга бўлса, 2 ва 3- ферментларнинг диссоция константаси ≈10-5 мол|л бўлган сорбент нисбатан кам ўxшашликка эга бўлади. 4- ферментнинг аффинлиги эса > 10^-3 моль/л тенг диссосация константаси билан баҳоланади. Бунда Ленгмюрнинг адсорбция изотеоремаси тенгламасини қуйидаги умумлаштирилган холда ёзиш мумкин.