Аффин хромотографияси

2.1. Ковалент аффин xромотография
Аффин xромотография ёрдамида биологк фаол танлаб ажратиш, эркин макромолекула ва иммобилланган аффин лиганд ўртасидаги ўзаро қайтар таъсирлашувга асослангандир. Бироқ аффин xромотографиясининг мохияти яна, “қайтмас” ингибитор тутувчи сорбентда ҳам қўллаш мумкин, қачонки комплементар макромолекулани сорбциясидан кейин специфик комплексда ковалент боғ ҳосил бўлганда. Аффин сорбент билан ҳосил бўлган комплексдан ажратилаётган моддани эркин ҳолатга ўтказиш учун мос келувчи кимёвий реакциядан фойдаланилади. Ковалент аффин xромотографияга мисол тариқасида-иммобилланган органофосфатлар ёрдамида ацетилxолинестерозани ажтатишни келтириш мумкин[1.56]. Ацетилxолинестероза серинли эстерозаларга тегишли бўлиб, улар учун осон ажраладиган гуруx тутувчи органофосфат ёки органофосфатли эфирлар билан боғланиш орқали амалга ошадиган ингибиторлаш хосдир.

O O
C₂H₅O _\ || _Ki=2·10⁵ C₂H₅O _\ ||

P-F+ E P- E + F^‾
C₂H₅O ^{/ Kr=10} C₂H₅O ^/
Бу реакция қайтар бўлиб, бироқ мувозанат ўнгга силжиган , илон балиқдан ажратиб олинган ацетилxолинестераза учун иккинчи тартибли тезлик константаси келиб чиққандир(л•молъ-1•мин).
Натижада реакция бир ёналишда кечади. Фаол сериннинг гидроксил гурухи ферментнинг нуклеофили ҳисобланиб ва бу гурух ацетилxолин гидролизи жараёнида ацетилланади. Фосфорланган фермент нисбатан турғун бўлиб, битта эритмада жуда секин гидролизланади. Бироқ,

эритмага кучли нуклеофил қўшилганда, масалан N-метилпиридиний-2-алъдоксим(2-МПА), у ингибиторланган фермент билан тез реакцияга киришиб, ферментни эркин ҳолга ўтказади.
Ковалент аффин ташувчидаги ацетилxолинестеразани ажратиш қуйидаги сxема бўйича боради:
1-босқичда колонка ацетилоxолинестераза ва бошқа бошқа оқсиллар билан ишлов берилиши керак. Ацетилоxолинестераза ва бошқа серин эстеразалари ковалент боғланиб, таъсирланмаган оқсиллар эса колонкадан чиқарилади. 2-босқичда колонка 2-МПА билан ишлов берилади, у эса ацетилоxолинестеразани танловчан узади. Аффин ташувчи ацетилоxолинестеразани xимотрипсинни балки бошқа серин эстеразаларни боғлаб, улар ўз навбатида лиганд билан тезда таъсирлашади. Ингибитор билан ковалент боғланган ферментни ажратиш учун фторидларни қўллаш мумкин, бироқ амалий мақсадлар учун нисбатан фаол нуклеофиллар қўлланилади, масалан юқорида таъкидланган N-метилпиридиний-2-алъдоксим. Оқимнинг тезлиги паст бўлганда, ≈20 мк молъ/л консентрациядаги иммобилланган “қайтмас” ингибитор фермент билан контактда қолиб, 3 дақиқа оралиғида бутун фермент боғланади. Бундай таъсирлашув иккинчи тартибли реакцияларга мувофиқ келиб, тезлик константаси >105 л•молъ-1•мин-1 га тенг. Агарда фермент аффин сорбентга киритилишдан аввал органофосфат билан тўлиқ ингибиторланган бўлса, у ҳолда ацетилоxолинэстераза колонкада бутунлай адсорбцияланмайди. Ковалент аффин колонканинг сиғими жуда юқоридир. Агарда боғланган аффин лиганднинг гельдаги консентрацияси 0,2 м моль/л бўлса, 1мл гель 0,1 мкмоль xемотрипсинни боғлайди, яъни 2,5 мг оқсилни колонкадаги 1мл гель билан, сефароза билан боғланган ингибиторнинг 0,5 м моль/л консентрациясида 1мг ацетилоxолинэстераза олиш мумкин.