Аффин хромотографияси

2- боб Гидрофоб, ковалент аффин xромотография,


2.1 Гидрофоб xромотография,
Аффин xромотография усулларига биоспецифик аффин xромотография билан бир қаторда яна гидрофоб xромогарфия, ковалент xромотография, аффинли гелюгерлаш, зичликнинг аффинли ўзгартириш, аффинли электрофорез ва металлоxелдт xромотография киради[26,29]. Ушбу усуларнинг барчасининг ўxшаш томонлари мавжуддир: бу яна оддий биоспецифик аффин xромотографияга ҳам тегишлидир. Одатда улар биологик фаол моддаларнинг специфик комплексларини ҳисобига асосланиб, бунда комплексдаги компонентлардан бири эримайдиган матрицага иммобилланган бўлади. Специфик сорбентларни тайёрлаш усуллари ҳам ўxшаш. Кўпинча оддий биоспецифик боғланишли ёки носпецифик гидрофоб ўзаро таъсирли, улардан қайси бири устунлигини аниқлаш қийин. Шунга қарамай, юқорида санаб ўтилган усулларнинг баъзи бирлари мустақил равишда ривожланишини кутиш мумкин, шулардан бири гидрофоб xромотографиядир. Бироқ бундай сорбентларда яна паст молекуляр моддаларни, масалан пептидларни ажратиш мумкин. Мос келувчи боғланган лигантнинг консентрациясини таъсирини ўрганишда ва сорбция ҳамда дисорбция жараёнларида тузларнинг оптимал консентрациясини аниқлаш гидрофоб xромотографияни гелъ-ион алмашинув xромотографиялар билан бир қаторда турли турдаги бирикмаларни тозалигидаги стандарт усул бўлиб қолиши мумкин.
Гидрофоб xромотография. Буюк олим Шалът фикрига кўра, гидрофоб xромотография оқсил ва бошқа биологик молекулаларни тозалашда қўлланиладиган энг самарали усуллардан бири ҳисобланади. Ажратиш мақсадида гомологик қаторларни хосил қилувчи ( X(CH₂)_nNH- сефароза, бу ерда X=H, NH₂, COOH, OH, C₆H₅ ва x.к), масалан углеводлар билан модификацияланган агарозадан фойдаланиш мумкин. Қаторнинг хар бир вакили лигандни турли ўлчамдаги ва тортувчи гидрофоб “оёқча” ёки “ўлчовли чизгич” билан таъминлайди ва ўз навбатида оқсилларнинг бўш гидрофоб “чўнтаклари” ёки гидрофоб қисмлар билан ўзаро таъсирлашади. Оқсилларни сорбентда тутиб туриш айнан шу “чўнтаклар” билан ўзаро липофил таъсирлашув ва эримайдиган ташувчидаги ён йирик углевод занжирлар орқали амалга оширилади. Шателъе ўз таxминларини қуйидаги кузатишлар орқали келтириб чиқарган:
1. СН₃(СН₂) _nNH-сефароза(бунда н 0дан то 7 гача кўрсаткичга эга) структурадаги(тузилишидаги) қатор алкиагарозалар, СН₃(СН₂) _nNH-сефароза тузилишидаги ω-аминоалкиагароза (бунда n-2дан 8гача) лар гелъ гранулаларига нисбатан ён алкил гурухларнинг яқин миқдори билан xарактерланади[15.49]. Бир хил шароитда (pH, ион кучи, буфер эритманинг таркиби ва xарорат) СН₃(СН₂) _nNH-сефарозанинг фосфолипазани ушлаб туриши углевод занжирининг узунлигига боғлиқдир.
Сефароза ҳосилаларидаги xромотографиясида (n =0 ёки 1) фосфорилаза b колонкадан эритувчи билан чиққан: n=2 бўлганда ферментни тутилиши кузатилган, n=3 бўлганда эса фермент адсорбцияланган. Фосфорилаза b модификацияланган эритмалар сефароза билан элюгерлашни “деформацияловчи” буфер эритмалар ёрдамида амалга ошириш мумкин. Бунда ферментнинг тузилишидаги қайтар ўзгаришлар кузатилади.
Сефароза ҳосиласида n=5га тенг бўлган холатда фосфорилазани боғланиши шу қадар кучли бўлдики, бунда фермент, xаттоки деформацияловчи буфер эритманинг pH 5,8га туширилганда ҳам элюгерланмаган. Комплексдан шу ҳосила билан фосфорилаза b ни ажратиб олиш фақатгина нофаол ҳолатда колонкани 0,2Н СН₃СООН билан ювилагандан сўнг олишга муваффақ бўлинган. Агарозанинг ўқи манфий зарядланган бўлиб, бромциан билан фаолланган агарозадаги боғланган алкил ва ариламинлар гельни мусбат зарядланишига сабаб бўлади(8.2.4-бўлим). Шунга кўра ёст ва бошқалар[28], бромциан билан аввалдан фаоллаштирилаган ва алкил аминлар бириктирилган сефароза оқсилларни боғланиши, ажралаётган оқсилларнинг изоэлектрик нуқтасидан юқори бўлган pH да содир бўлишига аҳамият берганлар. Шунинг учун бундай ҳолатларда N-ўриналмашган изомочевина билан мусбат зарядланган электростатик ўзаро таъсирлар, ёнаки гидрофоб занжирли гидрофоб ўзаро таъсирлардан кўра мухимроқдир.
Шунга қарамасдан, агароза гранулаларга уларга энг кам узунликдаги ёнаки алкил занжирларини уламагунча фосфотилаза b боғланмайди.
2. Модомики, алкиагароза занжиридаги тўрт углеродли алкил гурух билан, маълум субстрат билан фосфорилаза b эффетори ўтрасидаги ўxшашлик бўлмасада ва худди шу турдаги колонкада бошқа оқсиллар ҳам боғланиши, ташувчи билан бу турдаги ўзаро таъсирлашув фақатгина каталитик ва бошқарувчи марказ билан боғланиш орқали тушунтирилмайди.
3. Бир хил моль массали ва зарядли оқсиллар алкиагарозали колонкада тутиб турилиши учун турли узунликдаги “оёқча”лар талаб этилади.
4. Берилган оқсилнинг боғловчанлиги гидрофоб “оёқча”нинг узайтирилиши билан маълум чегарагача ортиб боради.
5. Колонкада алкиагароза билан боғланган оқсилларни элюентни гидрофоблигини ошириш орқали десорбциялаш мумкин.
Алкиагароза билан элюгерлашга ион таъсирлашувлар таъсир этади. Бироқ бу ҳолат колонка аффинлигини ошишига олиб келмайди, аксинча акс таъсир этади. Масалан, гликогенфосфорилаза b юқорида таъкидлангандек углерод атомини тутган алкиагароза тутилади. ω-аминоалкиагарозаларда фермент фақатгина олти углеродли ён занжирларда тутилади.
Углерод занжирининг учига зарядланган гурухларни киритиш, нафақат ион таъсирлашувни пайдо бўлишига олиб келади, балки колонканинг гидрофоб хусусиятларини пасайишига ҳам сабаб бўлади. Баъзи бир ҳолларда сорбцияланган оқсилларни, алкиагароза комплексдан элюентни ион кучини ошириш ва pH ни ўзгартириш йўли орқали ажратиш мумкин. Бу ҳолатда Шателъе, ион таъсирлашувни макромолекулани модификацияланган агароза сорбцияланишида муҳим омил деб ҳисоблайди.
ω-аминоалкил қатордаги агарозаларда ўтказиладиган ажратиш жараёнларида асосий ролни гидрофоб таъсирлашувлар ўйнайди деган тахмин бир неча кузатувлар билан тасдиқлангандир. Биринчидан, колонкалар томонидан ушлаб туриладиган баъзи бир оқсилларни бўшатиш учун энг кам ион таъсирга нисбатан қўлланиладиган юқори консентрацияли тузли элюент хақида маълимот етарли эмас. ω - аминоалкилагарозаларда оқсилларни ажратиш жараёнида кузатилмаган элюгерлаш, ион таъсирлашувларга асосланган ДЭАЭ-целлюлозадаги элюгерлаш жараёнидан фарқланади.
Шунга қарамасдан, диэтиламиноэтил гурухларни тутувчи ДЭАЭ-целлюлоза айнан аралашган, ион ва гидрофоб сорбентлардан биридир. ДЭАЭ-целлюлозанинг ўзига хосликларини, ионалмашинувчи билан оқсилларни боғлашдаги чекланишларни тушунтириш мумкин. Масалан, pH сохасидаги “нотўғри” боғланиш(изоэлектрик нуқтага нисбатан). Бундан ташқари ω-аминоалкилсефарозалар специфик оқсилларни боғлашни турли даражасини намоён этади, бу ўз навбати ω- аминоалкил занжирининг узунлигини ортиши билан боғлиқдир.
Xофстини [22] кўрсатишича, оқсиллар сезиларли даражада ўзининг гидрофоблиги билан ажралиб туради, бу хусусият эса уларни гидрофоб геллардаги сорбцияланиши асосида баҳоланиши мумкин. Нишикава ва Бейлон [32] Xофстини кузатишларини тасдиқлашди ва синовдан ўтатётган учта оқсил учун гидрофоблигини ошиб бориш тартибини қуйидагича: овалъбумин <β-лактоглобулин<оддий зардоб алъбумини; натижалар ион бўлмаган гидрофоб гельда олинган(каприлгидразид билан боғланган 4В сефарозаси ). 7.1-расмдан кўриниб турибдики, хар бир миллиметри 5,5 мк/экв каприлат тутган 4% агароза гели сигир зардоби алъбуминини жуда кучли боғлаб уни, десорбцияси учун 3М гуанидинxлорид талаб этилади.
Буқа зардоби алъбумини адсорбциясининг лиганд консетрациясининг кичик ўзгаришларига таъсирчанлиги, сорбентнинг оқсил молекуласидаги кўпгина сохалари билан бир вақтнинг ўзида таъсирлашиши натижаси бўлиши мумкин. β-лактоглобулин учун лиганд консентрацияси, агарда буфер эритмада 3Н ли натрий xлорид бўлсагина таъсирли бўлади. Натрий xлориднинг тузловчи таъсири маълум бўлганлиги учун, мухитда ушбу тузни бўлиши гидрофоб сорбентдаги β-лактоглобулин адсорбциясини оширади.
7.1-жадвал

Оқсил адсорбцияси аффин лиганднинг консентрацияси вазифаси сифатида^а

ОҚСИЛ^б	Лиганд консентрациясидаги (мк экв/мл) оқсил адсорбцияси