Аффин хромотографияси

а) протеиназани йўқотмай амилазани тозалаш. Амилолитик фермент препаратларини (амилоризин П10х ва амилосубтилин Г3хларни) тозалаш учун маълум миқдорда улардан тортиб олиб, аммоний сульфат тузи ёрдамида чўктирдик (2-жадвал). Жадвалдан кўриниб турибдики, бунда фермент фаоллиги 2,8 марта ошади. Бунда протеаза фаоллиги сақланиб, 63,1 б/г ни ташкил қилади. Фермент препаратининг фаоллиги ион алмашинув хроматографиясидан сўнг янада ошиб, 70100 б/г, тозаланиш даражаси эса 29 марта кўтарилади. Бироқ, бунда протеиназа фаоллиги 16,3 б/г ни ташкил қилади. Шундай қилиб, тозаланган амилаза, тадбиқ этилган жараёнлар натижасида протеолитик ферментлардан ҳоли бўлмаганлигини олинган натижалар кўрсатиб турибди.
б) нордон протеиназларни йўқотиш орқали амилазани тозалаш. Юқорида кўрсатилган усулда тозалаш натижасида, тозаланган амилазалар гетероген ва гомоген вариантдаги ИЭТни ўтказишда ва коньюгатларни олиш учун қўйилган талабларга жавоб бермайди. Шунинг учун амилолитик фермент препаратларини тозалашда, ўзгача усул қўллашга тўғри келди. Негаки, тозалаш жараёнида ҳам, протеолитик ферментлар асосий оқсилларга салбий таъсир қилади. Шунга кўра, самарали усул ёрдамида нордон протеиназаларни йўқотиш мақсадга муофиқдир. Шу сабабли, амилолитик ферментларни протеиназалардан тозалаш учун, альбумин оқсили билан импрегнирланган полимер (сорсилен) қўлланилди. Бу ўтказилган тажрибалар ижобий натижалар берди.

2-жадвал

Амилоризин (Aspergillus oryzae) ва амилосубтилиндан (B. subtilius)a- амилазани тозалаш натижалари

№	Тозалаш босқичи	Оқсил концентрацияси мг/мл	Умумий оқсил, Мг	Амилаз фаоллик, Тб/г	Протеаз фаоллик Тб/г	Амилаз фаоллик бўйича тозалаш,
1	Тозаланмаган препарат: I II	39,2 36,5	860 790	2400 2143,0	195 182,6	1,0 1,0
2	Чўктириш NH4(SO4)2 I II	12,5 16,3	280 261	6800 5780	53,1 48,2	2,8 2,7
3	ИАХ I II	0,6 0,65	13,3 15,7	70100 68000	16,3 15,42	29 31,7

I - амилоризин, II – амилосубтилин

Сорбент, қорамол зардоби альбумини билан импрегнирланган бўлиб, сорбцияга жуда хос ва эритмадаги протеазаларни самарали боғлаш хусусиятига эга. Шу сабабли, протеазалардан амилоризин ва амилосубтилин препаратларини тозалашда, сорсилен ишлатилди. Оқсил субстратининг, гидролизини олдини олиш учун, шундай шароитлар танландики, бунда жараён давомида боғланиш (K_s ~ K_m) содир бўлиб, катализ эса кечмайди. (К₂≈0). Тажриба йўли билан шу нарса аниқландики, бунда муҳитга этанолнинг 20% эритмасини киритилиши, нордон протеазаларни полимерга сорбциясини кучайтирди. 3-жадвалда келтирилган маълумотлар тозалаш самарадорлиги ошиб бораётганлигини кўрсатади.

Жадвалдан кўриниб турибдики, биомахсус сорбент томонидан қайта ишлангандан сўнг, амилоризин фермент препаратининг фаоллиги ошган. Протеаза фаоллиги эса 2,8 мартага пасайиши кузатилган. Амилаза фаоллиги эса 7,4 баробарга ошган. Фермент фаоллиги ИОХда эса янада ошиб, (2 а,б -расм) 120 маротабага етган. Бунда табиийки, протеаза фаоллиги пасаяди. Ниҳоят, ультрагель АсА-54да ўтказилган гель-хроматографияда, юқори даражада тозаланган амилаза фермент препарати олинган.
Тоза ҳолда ажратиб олинган амилаза 700 000 б/г фаолликка эга. Бу препаратнинг протеаза фаоллиги, ўта оз миқдордалиги аниқланди (0.03 б/г) Амилаза фаоллиги бўйича, тозалик даражаси 290 мартани ташкил қилди.
3-Жадвал