Аффин хромотографияси

Aspergillus oryzae ва B. subtilis ни протеиназаларини дастлабки йўқотиш ёрдамида тозалаш натижалари

№	Тозалаш босқичлари	Оқсил концен-трация-си мг/мл	Уму-мий оқсил, мг	Амилаза фаоллиги, б/г	Протеаза фаоллиги б/г	Амилазани фаоллик бўйича тозалаш даражаси
1	Дастлабки препарат: I II	43,5 40,2	870 780	2400 2143	195 182,6	1,0 1,0
2	Сорбент билан қайта ишлаш: I II	22,0 19,8	440,0 420,0	8300 7500	62,3 56,9	3,5 3,5
3	Чўктириш NH4(SO4)2: I II	7,0 6,8	140,0 135,0	17800 18400	7,9 8,3	7,4 8,5
4	ион алмашинув хроматография: I II	0,9 0,86	8,4 8,0	289000 310000	0,065 0,72	120 144,6
5	Гель-хроматография: I II	0,80 0,75	4,0 4,5	700000 610000	0,03 0,03	290 285

Изох: Жадвалда тагига чизилган рақамлар асосида келтирилган малумотлар, дастлабки контрол сифатида олинган амилаза ферменти фаоллигидан фарқланади.
I- амилоризин, II – амилосубтилин

Олинган препаратларнинг юқори тозаликка эга эканлиги, диск – электрофорез ДДС-Na ёрдамидада ўтказилиб, анод соҳасида ягона чизиқни мавжудлигини кўрсатди.

Шундай қилиб, биринчи бор биомахсус аффин хроматография усули билан амилоризин П10х, амилосубтилин Г3х препаратидан амилаза ферменти, электрофоритик тоза ҳолда ажратиб олинди. Олинган амилаза, нафақат турғун, балки, юқори тозалик даражасига ва фермент фаоллигига эгалиги аниқланди.

5-жадвал
Турли манбаалардан олинган ферментларни тозалаш натижалари

Фермент манбаалари	Ферментлар тури	Тозалаш босқичи	Тозалаш даражаси	Фермент фаоллиги мг/б
Қорамол ошқозон ости бези	Фосфолипаза А2	Биомахсус тозалаш	213,3 (130,3)	40 (390)
Глюкоаваморин Г3х	Глюкоамилаза	а) Биомах. Тоз б)иох в)гель-хромат.	270 (30)	670000
Кальмар ичаги	Нордон фосфатаза	а)чўкма б)ИОХ в)Гель. хром.	10,1	76,4
Амилоризин П10Х	а-амилаза	а) Биомах. тоз. б) ИОХ в) Гель-хром.	290 (29)	700000
Амилосубтилин Г3Х	а-амилаза	а) Биомах. тоз. б) ИОХ в) Гель-хром. .	144,6 (31,7)	310000
Картошка пўчоғи	Фенолоксидаза	а)чўктириш б)иох	29,2	92,4
Ўрта Осиё турпи	Амилаза	а) Биомах. тоз. б) чўктириш в) ИОХ	20,7	405,3
Ўрта Осиё карами	Амилаза	а) Биомах. тоз. б) чўктириш в) ИОХ	20,5	481,8
Базидиаль замбуруғ	Пероксидаза	а)чўкма б)иох в)гель-хром.	32,2	1232,0

Изох: жадвалда тагига чизилган рақамлар асосидаги натижалар кўрсатгичи, контрол сифатида олинган дастлабки фермент фаолликларидан фарқланади.


4.5.Иммуноконьюгатларни олиш ва уларни аффин хроматография усулида тозалаш
Иммуноэнзим таҳлилининг сезувчанлиги ишлатилаётган ингридиентлар тозалиги, хусусан, антитана ва антиген, ҳамда нишон сифатида танланган ферментнинг умумий фаоллиги ва тозалигига боғлиқ. Ҳозирги вақтда, ўзига хос, юқори фаолликка эга коньюгатларни олиш учун, бир босқичли ва икки босқичли синтез усуллари ишлатилади. Бир босқичли усулда фермент ва оқсил аралашмасига, глутар альдегид қўшилади. Икки босқичли усулда эса, фермент модификацияланади, сўнг эса антитана билан аралаштирилади. Бу усул оддийлиги билан фарқ қилади. Синтезланган коньюгатлар эса ўз хусусиятларига кўра зарур талабларга жавоб беради. Лекин шуни айтиш лозимки, реакцион аралашмада конъюгат ҳосил бўлмай, антитана-антитана, фермент-фермент каби компонентлар ҳам ҳосил бўлади. Бу эса, иммунтаҳлил сезгирлигига жуда қаттиқ таъсир қилади. Шунинг учун ҳозирги кунда коньюгатлар олиш усулларини, ноёб(оргинал) йўлларини ишлаб чиқиш зарурдир. Шунга кўра, ушбу ишда коньюгатлар олишнинг бир қанча усуллари ишлаб чиқилди:
1. Бифункционал бириктирувчи реагент ёрдамида коньюгат синтези (бир босқичли усул).
2. Дастлаб модификацияланган ферментлар билан қаттиқ ташувчида коньюгатлар синтези (мўлжалли услуб).
3. Дастлаб модификация қилинган антитаналар билан қаттиқ ташувчида коньюгатлар синтези (йўналтирилган услуб).
4. Трипсин ингибитори билан коньюгат синтези (протеолиздан ҳимоя усули).
Бир босқичли усулда коньюгат синтезлаш. Юқорида айтилганидек, бир босқичли усулда конъюгат синтез қилиш жараёни жуда содла ва оддийдир. Бунда биз дифтерия токсинига қарши олинган антитаналарни фермент молекулалари билан тўғридан-тўғри аралаштириб, тикувчи реагент қўшдик, сўнг 4⁰С ҳароратда 18 соат давомида инкубация қилдик. Диализдан сўнг, олинган коньюгаталарни ферментатив, серологик фаолликларини аниқладик. Бунда коньюгатлар фаоллиги, дастлабки амилаза фаоллигини 60% ташкил қилди. Таъкидлаш лозимки, бир босқичли усулда конъюгат олиш жараёни, бошқа бир қатор обьект антитаналари ва фермент молекулалари билан жумладан, ўсимлик вируслари (ТШ-ВТМ), сальмонеллез, стафилокок токсинлари билан бирга (фенолоксидаза, нордон фосфатаза, пероксидаза ва бошқалар) боғлаб конъюгатлар синтезланди ва фермент фаоллиги ўлчанди. Антитаналар билан фермент коньюгатлари ҳосил қилингандан сўнг, ферментнинг баъзи бир хусусиятлари ўзгариши мумкин. Шу сабабли, биз синтезланган конъюгатларнинг баъзи физ-кимёвий хусусиятларини ўрганиб чиқдик.(4а-расм) Бунда рН муҳитга боғлиқ фаолликни кўрсатувчи эгри чизиқ профили кенгайиши кузатилди. Дастлабки амилаза ўзининг mах.фаоллигини рН 5,0 да анча тор диапозонда юзага чиқарди (4б-расм).
Ферментнинг ҳарорат оптимуми, коньюгатланишгача ва ундан сўнг ҳам ўзгармади. Коньюгатлангандан сўнг, амилазани ҳароратга чидамлилиги ошди. Инкубация жараёнида 50 ⁰С ҳароратда, натив яъни дастлабки амилаза 60 дақиқадан сўнг, нофаол ҳолатга ўтди. Бу ҳолатда эса, коньюгат ўз фаоллигини узоқ вақт сақлаб турди (4в-расм ).
3г-расмда натив ва коньюгатланган амилазани 0,5-2,0% субстрат концентрацияда содир бўладиган, ўзгаришлари келтирилган. Расмдан кўриниб турибдики, амилаза антитаналар билан боғланганда, коньюгатланган ферментнинг гидролитик фаоллиги сусайиши кузатилади. Максимал фаоллик, натив ва коньюгатланган ферментда, субстрат концентрацияси 0,5% бўлганда кузатилади. (4г-расм 1-эгри чизиқ)
Олинган конъюгатларнинг серологик фаоллиги, диффузия усули билан текширилди. Бунда, ўйиқча четлари бўйлаб преципитация чизиғи ҳосил бўлиши, синтезланган конъюгатлар серологик фаол эканлигини кўрсатди.

Гидролиз даражаси
суб.
мин.

а) фермент рН оптимуми, б) 50⁰С даги ҳарорат кўрсаткичи, в) 50⁰С да фермент барқарорлиги, г) субстратга боғлиқлиги, 1 – конъюгат, 2 – дастлабки амилаза

4-расм. Амилаза ферментининг дифтерия токсинига қарши олинган антитела билан синтезланган конъгатининг баъзи физ-кимёвий хусусиятлари

Бу фермент билан антитананинг йирик агрегатлари ҳосил бўлишининг исботи ҳисобланади. (5- А, Б расм ).
Шуни таъкидлаш керакки, бир босқичли усул билан коньюгатлар олинганда, фермент томонидан нишонланган антитана билан бир қаторда, эритмада турли хил компонентлар ҳосил бўлади. Бу қўшимчалар коньюгатни амалиётда қўллашга ҳалақит беради ва усулнинг сезгирлигини пасайтиради. Шунинг учун коньюгатларни иммунтаҳлил усулларида қўллаш учун, уларни турли аралашмалардан тозалаш зарурдир.

А Б
А-антитана-антиген; Б-коньюгат ва антитана (Б расмда ўртадаги ўйиқчага конъюгат солинган). 5-расм. Иммунодиффузия