Аффин хромотографияси

Йўналтирилган услуб билан коньюгатлар синтези. Бу услубнинг ўтказиш жараёни конъюгат олишнинг мўлжалли (ориентир) услубига ўхшайди. Ушбу усулда ҳам коньюгатнинг синтези қаттиқ ташувчида ўтказилади. Бу усулни ишлашда, ташувчи сифатида полиамид ишлатилиб, сўнг дифтерия токсини антигени билан иммуносорбент синтезланди ва иммуносорбентга антитаналар сорбцияланди. Иммун комплекс ҳосил қилингандан сўнг, ташувчи юзасидаги антитана модификация қилинди. Антитана модификацияси 12 соат давомида NaIO₄ иштирокида ўтказилди, сўнг эса муҳитга 1 мг миқдордаги амилаза ферменти қўшилди ва 4⁰С ҳароратда 18соат давомида инкубация қилиниб, трис-HCl буферда рН 2,3 гача бўлган эритма билан коньюгат десорбцияланди. Бунда конъюгат чиқими 48,6% ни ташкил қилди. Йўналтирилган усул билан олинган коньюгатлар юқори каталитик ва серологик фаолликка эгалиги кузатилди.
Шундай қилиб, коньюгатлар олишнинг ўзига хос самарали усуллари ишлаб чиқилди.
Трипсин ингибитори билан конъюгат синтез қилиш. Турли усуллар билан синтез қилинган конъюгатлар узоқ муддат сақланганда, турли таъсирлар натижасида, жумладан протеолитик оқсиллар таъсирида уларнинг ферментатив ва серологик фаоллиги пасайиши мумкин. Шу сабабдан уларда антипротеолитик ҳимояни таъминлашни мақсад қилиб қўйдик. Ферментни протеолиздан ҳимоялаш учун трипсин ингибитори билан амилаза ферментини глутар альдегид орқали ковалент боғлаб, коньюгат олдик ва унинг баъзи хусусиятлари устида илмий тадқиқотлар ўтказдик.
Бу ўринда шуни айтиб ўтиш лозимки, коньюгатланиш натижасида, конъюгат таркибида, турли хилдаги бошқа компонентлар ҳам ҳосил бўлади. Бу компонентлар коньюгатлар хусусиятига қаттиқ таъсир қилиши мумкин. Шунинг учун биз олинган коньюгатларни турли компонентлардан ажратишни сефадекс G-75да амалга оширдик. 6-расмда кўриниб турибдики, оқсил эгри чизиғи ва трипсин ингибитори фаоллигига эга фракциялар шакл бўйича бир бирини такрорлади. Бу жараёнда биз, бир неча фракцияларни ажратиб олдик. Бу фракциялар ичидан энг фаол фракцияни олиб, хроматография қилдик (6-расм).

а- a-амилазнинг трипсин ингибитори билан конъюгати, б- дастлабки a-амилаза

6-расм. Амилаза ферменти гель-фильтрацияси

Бунда турли миқдорда ингибитор билан бириккан коньюгатланган ҳолатда, катта қисм амилаза ажралди. Колонкадан трипсин ингибитори билан бириккан коньюгат фракцияси ажралиб чиқди(5а расмда штрихланган 1-соҳа), сўнг эса трипсин ингибитори кам бўлган фракция чиқди (штрихланган 2-соҳа). Иккала фракциянинг ҳамда, дастлабки фермент ва коньюгатларнинг 50⁰Сдаги барқарорлиги ўрганилди. Бунда шу нарса маълум бўлдики, 2,5 соат давомида, 50⁰С ҳароратда трипсин ингибитор билан олинган коньюгат, дастлабки фермент фаоллигининг 80% ни сақлаб қолди. Бу вақтда дастлабки фермент ўз фаоллигини фақат 30 дақиқа давомида сақлаб, сўнг унинг фаоллиги йўқола бошлади. Коньюгатларни иккинчи фракцияси ҳам текширувларда анча барқарорроқ

бўлиб чиқди. Унинг термотурғунлиги 50⁰С ҳароратда 90 дақиқа инкубация қилиш билан кузатилди.
Кейинги тажрибаларни биз барқарор коньюгатлар билан олиб бордик. Бунда протеолитик таъсирга конъюгатлар турғунлигини аниқлаш учун эритма ёки коньюгатни (0.4мг/мл) трипсин билан бир соат давомида инкубация қилдик. Сўнг стандарт шароитларда фаоллигини аниқлаб, олинган натижа билан таққосладик. Олинган натижалар шуни кўрсатдики, трипсин ингибитори билан коньюгат синтез қилиш натижасида, амилаза ферментининг протеолизга чидамлилиги ошиши маълум бўлди.
Шундай қилиб, трипсин ингибитори иштирокида коньюгат олиш усули орқали, нишон сифатида олинган ферментларни, протеолиздан ҳимоя қилиниши кўрсатилди.