Аффин хромотографияси

3.2 Бошқа манбалардаги нордон протеиназаларни тозалаш

Ишлаб чиқарувчилар томонидан чиқарилаётган турли хил ферментлар кенг фойдаланиш билан ажралиб туради (амилазалар, протеиназалар, пектиназалар ва бошқалар). Кўпгина ҳолатларда бу каби фермент препаратларда шерик бўлаётган протеиназ фаоллиги етарли даражада юқори ва ишлаб чиқариш томонидан чиқарилаётган протеаз фаоллик билан таққослаш мумкин. Масалан, амилорезин П10х, целлолигирин П10х, ва протоаваморин П10х препаратлар таркибида нордон протоиназ борлиги уларда; 0,163; 0,20 ва 0,14 бир/ мг оқсилга эга. Шунинг учун нордон протеиназлар манбаси бўлиб хизмат қилиши мумкин, чунки улар ишлаб чиқарилиши яхши йўлга қўйилган.

Нордон протеиназларни турли хил манбалардан олиб биоспецифик тозалаш учун олинган сорбент ишлатилиши натижалари жадвалда кўрсатилган.
Биоспецифик сорбентдаги ферментнинг асорбцияси ва элюцияси А. oryzae даги нордон протеиназ учун оптимал шароитларда ўтказилади. Шундай қилиб, олинган натижалар шуни кўрсатадики, сорсиленни оқсил билан импрегнираллаш йўли билан тайёрланган сорбентлар микроорганизмлардаги нордон протеиназларни тозалашда муваффақиятли ишлатилиши мумкин.

1 – жадвал
Турли манбаалардаги нордон протеиназларни биоспецифик сорбент орқали тозалаш

Объект, тозалаш босқичи	Оқсил мг	Фаоллиги		Фаолликка қараб чиқиш	Фаолликка қараб тозалаш	Оқсилга қараб тозалаш
		Умумий бирлик	Чегараланган бирлик
Амилоризин П10х
- бошланғич препарат	19.6	3.2	0.163	100	1	1
- биоспецифик тозалаш	4.9	1.82	0.372	57	2	4
- гель – фильтрация	1.37	1.17	0.85	36.5	5	14
Целлолигнорин П10х
- бошланғич препарат	18.0	3.6	0.20	100	1	1
- биоспецифик тозалаш	4.0	1.9	0.46	50	2.3	4.5
- гель – фильтрация	0.85	1.2	1.4	34	7	21
Протоаваморин П10х
- бошланғич препарат	14	2.0	0.14	100	1	1
- биоспецифик тозалаш	4.3	0.86	0.20	46	1.4	3.2
- гель – фильтрация	0.46	0.6	1.3	30	9.3	30

4 БОБ. Турли манбадан ажратилган фосфолипаза ферментларини
биоспецифик сорбент ёрдамида тозалаш

Маълумки, сўнгги йилларда фермент препаратларига бўлган эхтиёж табора ортиб бормоыда. Шунингдек, липолитик фермент гурухларига кирувчи фосфолипаза ферментларига хам талаб катта бўлганлиги учун ушбу ферментни маълум манъбадан ажратиб олиш ва ўзига хос хусусиятларини ўрганишга эътибор қаратилмоқда. Бироқ, бу ўринда шуни айтиб ўтиш лозимки, бир қатор фосфалипазалар тозаланган ҳолда олинган, уларнинг биологик хусусиятлари ва ҳаракатланиш механизми батафсил ўрганилиб чиқилган. Бир вақтнинг ўзида ўсимликларда, ҳайвонларда ва микроорганизмларда кенг тарқалган фосфолипаза Д ва фосфолипид молекулалардаги фаол гуруҳлари ва фосфотидил қолдиқлар билан мураккаб эфир гидролизииннг каталик реакцияси ўртасидаги алоқаларни ўрганиш тўғрисидаги маълумотлар айтарли тўлиқ даражада ўрганилган эмас деса, муболаға бўлмайди. Сабаби, ушбу ферментннг физик, кимёвий ҳоссаларини аниқлаш бўйича турли тадқиқотчилариннг фикрлари турлича. Эҳтимол, бу фазаларни ажратиш чегарасида кечаётган ферментатив реакцияларни ўрганиш қийинлиги билан боғлиқдир. Бундай шароитларни ўзгаришида юзага келадиган субстратнинг фазовий ўзгариши ферментининг каталитик хоссаларини намоён қилишда ҳал қилувчи ролни бажариши мумкин. Буларнинг қарама-қаршиликлари шундаки, кўпгина тадқиқотлар фақатгина қисман тозаланган фосфолипаза Д препаратларида ўтказилганлигида фосфолипазани қисман тозалашнинг маълум бўлган методлари жуда қийин ва фермент чиқиши эҳтимоли жуда паст. Фақатгина сўнгги йилларда тозалашининг қатор юқори самарадорлигининг янги методлари ишлаб чиқилмоқда ва шулар қаторига аффин хромотографияси методи киритиш мумкин. Ушбу усул асосида Фосфолипазасини Д ферментини бир неча гомологик кўринишларини олишга эришилди.

Мазкур ишда ферментнинг турли молекуляр шаклларини ажратиш имконини берувчи адсорбцион биоспецифик хромотографияси методи ишлаб чиқилиб ва шу билан бирга ферментнинг турли молекуляр хоссаларн хам ўрганилди. Қуйида олиб борилган тажриба шароитлари келтирилган.