Аффин хромотографияси

3 БОБ. БИОСПЕЦИФИК ХРОМОТОГРАФИЯ ЁРДАМИДА
НОРДОН ПРОТЕИНАЗЛАРНИ ТОЗАЛАШ
Ҳозирги кунда нордон протеиназларни ажратиб олиш ва тозалашнинг турли хил схемалари мавжуд. Шу қаторда биоспецифик хромотография методлари хам киради. Биоспецифик хромотографияда лигандлар сифатида нордон протеиназлар билан яқин бўлган ҳам юқоримолекуляр, ҳам пастмолекуляр бирикмалардан мувафаққиятли фойдаланилиб келинмоқда.
Масалан, биоспецифик полимер лигандлар сифатида синтетик полимизин, оқсил – гемоглобин ва овомукоид, диминераллашган хитиннинг натив оқсилли қисми ишлатилади. Шу каби сорбентлар қатор ферментлар ичидан протеолитик ферментларнинг аффин хромотографияси учун жуда самарали бўлди. Шу билан бир қаторда, кўпгина ҳолларда ковалент боғлиқ лигандларда биоспецифик хромотография методлари кўп босқичли бўлади, айниқса, у ёки бу лиганд гуруҳлар билан синтез килинганда ва тозаланган ферментларни паст чиқиши билан тавсифланади.
Мазкур ишнинг мақсади нордон протеазларни тозалаш учун импрегрир альбумин ва сарсилен желатиннинг самарадорлигини ўрганишдир.
Бу ерда ишлаб чиқарилган амилоризин П10х, протоаваморин П10х ва целлюлигнин П10х фермент препаратлари ишлатилган.
Нордон протеазларни тозалаш учун биоспецифик сорбентларни буқанинг зардобли альбуминини импрегнирлаш орқали ёки сорсилендаги озуқа желатинини импрегнирлаш орқали олинади. Импрегнирлаш қуйидагича амалга оширилади: 1 гр сарсиленни 5 карра сиғимда 1 % суспендирланади БСА эритмасини (ёки желатиннинг) 0,05 универсал буферида (Н₃ВО₄ – Н₃РО₄ – СН₃СООН - NаОН), рН-3.5. аралашмани аралаштиришади ва 6 -10 ⁰С даражада 10 – 12 соат давомида сақлайдилар. Ундан кейин эса таркибида 20 % этанол бўлган буфер билан ювилади. Бундан сўнг таркибида 20 % этанол бор рН 3.5, 0,05 М да тайёрланган буферда 3 мгмл оқсилли концентрацияга эга нордон протеиназ препарати эритмаси қўшилади. Буларнинг ҳаммаси аралаштирилади ва 6-10 ⁰С да 15-20 минут давомида сақланади. Кейин сорбентни – 20% этанол эритмасида 5 марта ювиб олинади ва ювилган қисмини центрифугирлаш орқали ажратиб олинади (6000g, 10 мин). Боғланган нордон протеиназани таркибида 20 % этанол бўлган 0,5 NaCl ни ишлатган ҳолда ташувчилари билан десорбцияланади. Сорбентдан элюирланган фракцияни кейин колонка орқали гелли фильтрлашга жўнатилади. Элюатларда Лоури бўйича оқсил таркибини аниқлашади. Нордон протеиназнинг фаоллигини анионнинг моделлаштирилган усули ёрдамида ўлчашади:0,1 М универсал буфер муҳитида 1 мл 2% ли БОА эритмасини, фермент сифатида эса таркибида 0,02 – 0,03 бирликдаги фаол (мкмоль) тирозин (1 дакикада) нордон протеиназа эритмаси ишлатилади.
Маълумки, нордон протеиназлар альбумин ёки желатинга ўхшаш оқсил субстрат билан жуда ўхшаш. Улар билан бирикиш мустаҳкамлиги бошқа субстратлар ёки синтетик пептидларга нисбатан анча юқори (лекин каталитик босқичи секинрок кечиши мумкин). Шунинг учун биз шу субстратлар асосида оқсиллар билан импренирлашган тешик ташувчиларни ишлатган ҳолда биоспецифик сорбентлар яратиш мумкинлигини таклиф қилдик.
Қатор сорбентларнинг олдиндан ўтказилган синовларидан сўнг (полиамидлар, базальт тўқималари, ноорганик полимерлар, Millipore сингари фильтрловчи материаллар) синтетик сорбент – сорсилен 2-3 см³г сиғимга ва 50-120 м²г полимер сиртига эга. Оқсилли комплекслар рН 3,0-7,5 да 2 М туз эритмада доимий бўлади.