Аффин хромотографияси

Тадқиқотни амалга ошириш
Фосфолипаза ферментининг манбааси сифатида чўчқанинг ошқозон ости бези, Naja naja oxiana кобраларининг бутун заҳри ва CaCl₂ устида қуритилган чўл қора илони Vipera ursini renardi нинг заҳарлари, катта асалари Vespa orientalis нинг лиофилланган заҳри ишлатилади. Фосфолипазаларнинг фаоллигини потенциометрик титрлаш методи асосида ўзгармас рН да ўлчанади. Субстрат сифатида қуйидаги тартибда тайёрланган тухум сариғининг гомогенланган эмульсияси қўлланилади: битта тухум сариғини тенг ҳажмдаги бидистилланган сув билан аралаштирилади ва РТ – 1 тўқима майдалагичида 10 минут давомида 8000 айл/мин тезликда гомогенизацияланади, шундан сўнг аралашманинг ҳажмини сув билан 100 мл гача етказилади. Реакцион аралашма умумий ҳажмда 14 мл да 2.5 мл субстрат ва 10 мМ рН 8.0 бўлган СaCl₂ мавжуд. Реакцияни 0.1 – 0.2 мл фермент эритмасини рН статнинг термостатли ячейкасига қўшиш билан бошланади ва 40⁰ да 10 – 15 мин давомида ажралаётган ёғ кислотасини
КСП-4 самописеци ёрдамида аниқлаш орқали олиб борилади. 1 гр оқсилга нисбатан олинганда 1 мин давомида ажралаётган ёғ кислоталарининг солиштирма активлигини мкм ларда ифодаланади.
Оқсилни спектрофотометрик усулда Лоури методи бўйича 280 нм да назорат қилинади.
Биоспецифик адсорбентнинг синтези қуйидаги услубда амалга оширилади: 10 гр капрон тўқимаси 100 мл сульфат кислотада (d=1.19) эритилади ва олинган капроннинг қисман гидролизланган эритмаси 50 мл/ч тезликда томчилаб қўшилган 500 мл сув билан аралаштирилади. Гранулаланган капронни Бюхнер воронкасида ажратилади, 100 мл ацетон ва 50 мл диэтил эфирида ювилади. Қуритилган капрон кукуни сито (100-300 мкм) дан ўтказилади. Ташувчининг фаолланиши бўйича кейинги операциялар, унинг глутар альдегиди билан модификацияси, лиганднинг бириктирилиши (фосфотадилэтаноламин) ва этаноламин ташувчиси эркин фаол гуруҳларининг тўсиб қўйилиши олдин таърифланиши олиб борилади.
Бунинг учун полиамид кукуни 5 мартали сульфат кислотанинг 3 н ли миқдорида суспендирланади ва икки соат давомида 45⁰ С да аралаштирилади, полиамид сув ва 0.1 М рН 8,5 ли борат буферида ювилади. Ҳар ювишдан сўнг полиамид центрифугалаш ёрдамида ажратилади (6000 айл/мин, 15 мин). 0,1 М рН 8,5 ли борат буферида мувозатлаштирилган фаоллаштирилган полиамид суспензиясига 5 мартали ҳажми бўйича 12,5 % глутар альдегиди қўшилади ва икки соат давомида аралаштиришга қўйилади. Бунда глутар альдегиднинг бир қисми ташувчи эркин аминогуруҳлари билан Шифф асосининг ҳосил бўлиши билан таъсирлашади. Таъсирлашмаган глутар альдегиди айнан ўша буфер эритманинг 10 марталик ҳажми билан ювилади.
0,1 М рН 9,6 ли борат буферидаги ўзгартирилган полиамид суспензиясига беш марталик ҳажми бўйича умумий фосфалипидлар суспензиясига тенг 40 мг/мл концетрацияли айнан шу буфер эритмали қўшилади, фосфалипидлар ва ташувчининг масса нисбатлари қуруқ масса ҳисобида 1:5 ни ташкил этади. Аралашмани доимий аралаштирилган ҳолатда икки сутка давомида 4⁰ С да сақланади. Бунда фосфатидилэтаноламинниг ўзгартирилган ташувчи билан Шифф асосини ҳосил қилган ҳолда, ковалент боғланиши содир бўлади. Боғланмаган фосфалипидлар адсорбентни 10 марталик ҳажмдаги диэтил эфири билан ювилиши орқали ювиб ташланади.
0,1 М рН 9,6 ли борат буферида мувозанатлаштирилган олинган адсорбентга 0,5 мл ҳисобидан 1 гр адсорбентдаги этаноламин қўшилади ва аралаштиришга 24 соат давомида 4⁰ С да қўйилади. Бунда ташувчининг қолган эркин альдегид гуруҳлари этаноламин томонидан тўхтатиб қўйилади. Ортиқча этаноламин адсорбентни 5 марталик ҳажми бўйича айни шу буфер эритма миқдоридаги эритма билан ювиш орқали йўқотилади.
А₂ фосфолипазаларнинг синтезланган адсорбентдаги адсорбцияси ва десорбциясининг оптимал шароитларни аниқлаш статик шароитларда 2 мг кобра заҳарини 1 гр адсорбент билан 5 мл буфер эритмада (5 ва 6-жадвал) 20⁰ С да 1 соат давомида инкубация йўли билан олиб борилади.