Аффин хромотографияси

5 боб Биоспецифик хроматография асосида ўсимлик вирусига қарши антитаналарни тозалаш
Охирги пайтларда янги иммунологик анализ методларининг ривожланиши натижасида юқори титрли турли ўсимликлар вирусларига специфик антизардоблар талаб қилинмоқда. Бу методларнинг сезгирлигини ошириш ва носпецифик реакцияларни йўқотиш учун қўлланилаётган антителаларнинг юқори тозалиги катта аҳамият касб этади. Бу асосан ҳужайрада унчалик кўп бўлмаган миқдорда тўпланадиган вирусларни диагностикаси учун муҳим ҳисобланади, масалан, баъзи потивируслар. Виробактериал агглютинация (АБВ – тест) ёки иммунофермент анализ каби тезлаштирилган ва юқори сезгирли методларнинг ишлаб чиқилиши аниқ вирусга қарши юқори тозаликка эга антитела препаратларини олишда етарли даражада сабаб қилиб кўрсатилади.
Олдинроқ тамаки мозаикаси вирусининг (ТМВ) томатли штаммини тозалаш методи кўрсатилган эди ва унинг полиамид гранулаларидаги иммобилизациясининг қулай усули ишлаб чиқилди. Ушбу мақолада натижалари келтирилган кейинги эксперементал тадқиқотлар ушбу вирусга қарши антителаларни сорбент сифатида ТМВ томатли штаммининг иммобилланган кўринишидан фойдаланган ҳолда биоспецифик тозалаш усулини ишлаб чиқишга бағишланган.
ТМВ – ТШ нинг ажратилиши ва унинг тозаланиши юқорида келтирилган усул асосида олиб борилади. ТМВ га қарши антизардобни қуёнларга қулоғининг ён венасига антигенни ички киритиш орқали ошиб борувчи концентрацияда (3,5,7,9,11,13 мг) физиологик эритмада (1:1) инъекциялар орасидаги 1 кун интервалдаги иммунизация орқали олинади. Умумий ҳолда 48 мг антиген киритилади. охирги инъекциядан 10 кун ўтганидан сўнг қон олинади. Олинган қонни 40⁰ С да 8 – 10 давомида сақланади, 0 – 2 ⁰С гача совутилгандан кейин 5 – 6 соатдан сўнг зардобни қоннинг нормал элементларидан 6000 айл/мин тезликда 20 минут давомида центрифугалаш билан ажратилади. Зардобнинг титри икки марталик диффузия методи билан аниқланади. ТМВ – ТШ нинг иммобилланган формасини худди ушбу ишда кўрсатилган усулдагидек кўринишда олинади.
Иммобилланган вирусдаги антителалар сорбцияси оптимал шароитларини рН қийматларини, кальций ва этиленгликолнинг концентрацияларини ўзгартириб ўрганилади. Ушбу тажрибаларда 50 мг биоспецифик сорбентга 0,5 мл антизардоб ТМВ – ТШ га 1,5 мл 0,1 М ацетат буфери рН 4.0 да қўшилади ва 2 соат давомида инкубацияланади. Инкубациядан сўнг аралашма 6000 айл/мин да центрифугаланади. Антитела таркибини баҳолаш тўрт баллик шкалада визуал равишда амалга оширилади.рН>6.0 бўлган қийматларда 0.05 М трис – буфери ишлатилади. Антителаларни анализ қилиш учун уларни сорбентдан қуйидаги тартибда десорбцияланади: дастлаб 0.85 % ли натрий хлор тутувчи рН 9.7 бўлган 2 мл 0.05 М трис – буфери қўшилади ва 6000 айл/мин да центрифугаланади. Кейин сорбентга айнан шу таркибдаги десорбцияловчи эритма юқорироқ қийматдаги рН (10.5 – 11) билан қўшилади. Биринчи ва иккинчи десорбциядан сўнг олинган антителалар бирлаштирилади. Икки марталик диффузияни ўтказишдан олдин рН нинг қиймати 7.0 гача етказилади. Этиленгиликоль (20 % гача) ва кальций хлорид (10 дан 30 мМ гача) ва бошқа қўшимчалар буфернинг таркибига киритилади. Десорбциянинг оптимал шароитларини инкубацион муҳит таркибини, инкубация вақти ва муҳит рН ини ўзгартирган ҳолда аналогик усулда аниқланади.
12 г сорбентга антителаларни препаратив олиш учун 100 мл 0.05 М трис – HCl рН 7.0 га 45 мл антизардобни (антизардоб концентрацияси оқсил бўйича 43 мг/мл, яъни умумий ҳолда 1935 мг) 30 мМ кальций хлорид иштирокида қўшилади ва музлатгичда 2 соат давомида доимий аралаштириш асосида инкубацияланади. Антизардобнинг адсорбцияланмаган қисми центрифугаланиш йўли билан ажратилади. Десорбция мақсадида чўкмага 60 мл 0.05 М трис – ОН рН 11.0 1 М KCl (охирги концентрация) билан биргаликда қўшилади. 30 – 50 минутдан кейин 6000 айл/мин да 10 минут давомида центрифугаланади. Сўнг иккинчи марта десорбция 50 мл десорбцияланувчи эритмада ўтказилади. Центрифугалаш натижасидаги десорцияланган антителалар ажратиб туриб, рН ни 7.0 гача туширамиз ва уларнинг миқдорини спектрофотометрик усулда аниқланади.
Тажрибаларда қуйидаги реагентлардан фойдаланилган: (“Reanal” Венгрия), полиэтиленгликоль (“Schuchardt”, ГФР), бактоагар (“Difco”, АҚШ), KCl, CaCl₂, NaCl, NaOH, сирка ва сульфат кислота, ацетон, этиленгликоль, моноэтаноламин – барсачи ватанимизда ишлаб чиқарилган. Моноэтаноламин фойдаланишдан олдин қўшимча равишда ваакуум остида ҳайдалади. Полиамид гранулалари лаборатория шароитларида тўқимачилик саноати чиқиндиларидан олинади.
Биоспецифик сорбентни тайёрлаш учун оптимал форма бу 140 дан 250 мкм гача ўлчамдаги полиамид гранулалари ҳисобланади. Бу ташувчида глутар альдегиди ёрдамидаги ТМВ – ТШ ковалент иммобилизациясида 1 г сорбентга 74,9 мг вирус боғланади.
рН нинг антителалар сорбциясига таъсирини ўрганиш кўрсатишича (9.1-расм) максимал адсорбция рН нинг 7.0 (1 г сорбентга 28 мг) қийматида содир бўлади. Муҳитнинг рН қийматининг пасайиши ёки кўтарилиши антителалар адсобциясини ёмонлаштиради.
Умумий оқсилнинг сорбцияси ва антителалар сорбцияси (алоҳида намуналардаги десорбция бўйича баҳоланувчи) ноадекват ҳисобланади. Оқсилнинг боғланиши рН қийматининг ошиши билан ортади, лекин, рН 9.0 да адсорбцияланганда иммунологик фаолликка эга бўлмайди. Тахмин қилиш мумкинки, рН нинг камайишида ёки аксинча, унинг ортишида сорбентда оқсиллар (вирусларга антитела бўлмаган) сорбцияланади. Айнан рН 7.0 да иммобилланган вирус билан инкубацион муҳитдаги сорбция жараёнида специфик антитела боғланади.
Антителалар сорбцияси жараёнида этиленгликоль ва кальций ионлари таъсир кўрсатади. Этиленгликолнинг 5 % ли концентрациясининг қўшилиши бу жараёнда оқсилнинг умумий сорбцияси камайсада, кўпроқ даражада специфик антителаларнинг сорбциясини яхшилайди (9,11 – расм). Этиленгликолнинг янада баландроқ концентрациялари оқсилнинг сорбцияси кўтарилсада, антителаларнинг сорбциясини яхшиламайди.
Антителаларнинг сорбцияси жараёнига кальций ионлари ҳам мусбат таъсир кўрсатади. Антителалар билан олинган преципитация чизиқлари сорбция жараёнида инкубацион муҳитга 5 % ли этиленгликоль ва CaCl₂ ни 10

Кальций концентрацияси, мМ Инкубация вақти, ми

9 – расм. рН нинг (I), элиленгликоль концентрациясининг (II) ва кальций ионларининг (III) антителалар сорбцияси жараёнига таъсири. Р – 1 г сорбентда десорбцияланган оқсилнинг миқдори (мг ларда), А – десорбцияланган антителалар иммунологик фаоллигини баҳолаш (балларда).

10 – расм. Антителалар десорбцияси жараёнига турли омилларнинг таъсири. Тушунтириш I – расмда келтирилгани сингар

дан 30 мМ гача (9, III - расм) қўшилганда аниқ ва пухта бўлади. Демак, бу қўшимчалар антителанинг лиганд билан боғланишига имкон яратиб беради.
Антителанинг иммобилланган вирусдан десорбцияси сезиларли миқдорда эритманинг ион кучи ва муҳитнинг рН ига боғлиқ бўлади. 10, I – расмдан кўриниб турибдики, десорбцияланувчи эритмада калий хлориднинг концентрацияси 2 М гача бўлганда десорбцияланган оқсилнинг миқдори бирмунча камаяди. Кўпроқ серологик фаолликка 1.0 дан 1.5 М гача десорбланувчи эритмадаги калий хлорид концентрациясидаги десорбланган оқсил фракциялари эга бўлади. Бунда антителаларнинг чиқиши 1 г сорбентга 5.4 – 7.0 мг ни ташкил этади. Антителаларнинг чиқишининг худди шундай миқдорига KCl ни NaCl га алмаштирилганда ҳам эришиш мумкин. 15 % ли NaCl концентрациясида ва муҳитнинг рН и 10.5 бўлганда антителаларнинг чиқиши 1 г сорбентга 7.8 мг ни ташкил этади (10, 11 - расм).
Биоспецифик сорбентдан антителаларнинг десорбцияси етарли даражада секин кечади. Антителаларнинг рН 10.5 даги максимал десорбцияси учун 30 минут талаб қилинади, антителаларнинг максимал чиқиши учун эса 120 минутдан сўнг амалга ошади.
Олинган натижалар сорбентдан антителалар сорбцияси ва десорбцияси оптимал шароитларини топишга имкон берди ва антителаларни препаратив олишнинг асоси сифатида қаралди. Шу мақсадда статистик шароитларда 12 гр биоспецифик сорбентга 45 мл 43 мг/мл оқсил концентрацияли антизардоб қўшилади. Кейин 100 мл адсорбцияловчи буфер (0,05 М трис–НCl – 30 мМ CaCl₂ + 5% этиленгликоль) киритилади ва аралашма 2 соат давомида доимий аралаштириш орқали музлаткичда инкубацияланади. Адсорбцияланмаган антитела центрифугалаш орқали 6000 айл/мин да 10 минут давомида ажратилади. Чўкма худди ўша буферда оқсил излари йўқолгунча (280 нм даги оптик зичлиги бўйича) тўрт марта ювилади. Анализларнинг кўрсатишича, бирлаштирилган супернатант ва суюқликнинг ювилиши 1740,8 мг оқсил тутади. Демак, иммобилланган вирус билан боғланган оқсилнинг миқдори 194,4 мг ни ташкил этади. Антителаларнинг десорбцияси чўккан гранулаларга 1 М ли KCl тутувчи 60 мл 0,05 М трис – NaOH буфери рН 11,0 ни қўшиш орқали амалга оширилади. 120 минутдан сўнг аралашма центрифугаланади ва супернатант таркибидаги оқсилнинг таркиби аниқланади. Диализдан сўнг антителали эритма ампулаларга (2 мг ли) бўлинади ва музлатилган ҳолатда сақланади. Антитела лиофилизациягача ва ундан сўнг иммунологик фаолликни намоён этади.
Юқоридаги келтирилган натижаларни жамлаган ҳолда, хулоса қилиш мумкинки, тамаки мозаикаси вируси томат штамларига зардоб компонентларининг биоспецифик хромотография методи агар хромотография учун сорбент сифатида полиамид гранулаларни уларга вирусларни иммобиллаган ҳолда қўлланилса, юқори иммунологик фаолликка эга тозаланган антителаларни олиш имконини беради.

5.1.ТРИПСИН ИНГИБИТОРИНИНГ