Аффин хромотографияси

5 – жадвал
Фосфолипаза А₂ нинг биоспецифик адсорбент билан боғланишида
муҳит таркибининг таъсири

№	Фермент адсорбцияси шартлари	Боғланган фермент миқдори, %
I.	Чўчқа ошқозон ости бези фосфолипаза А2 си (100 мг фермент кукуни 1 г сорбентда) 0.01 М трис – HCl –буфери, рН 8.0 10 мМ СаCl2 тутувчи айни шу буфер 4 мМ натрий дезоксихолат 10 мМ СаCl2 ва 4 мМ дезоксихолат	74.0 99.0 64.7 100
II.	Кобра заҳари фосфолипаза А2 си (1 г сорбентдаги 25 мг заҳар) М трис – HCl –буфери, рН 8.0 10 мМ СаCl2 тутувчи айни шу буфер 10 мМ СаCl2 ва 1 М KCl	100 100 100

6 - жадвал


Биоспецифик сорбентдаги фосфолипаза А₂ нинг
элюция шартларини аниқлаш

№	Элюирланувчи эритма	Десорбцияланган фермент миқдори, %
I.	Панкреатик фосфолипаза А2 0.01 М трис – HCl –буфери, рН 8.0 10 % диметилсульфоксид тутувчи 2.5 % мочевина 10 мМ цетилтриметиламмоний бромли 0.1 % ли тритон Х - 100	30.2 83.0 60.3 76.3
II.	Кобра заҳари фосфолипаза А2 си М трис – HCl –буфери, 0.1 % тритон Х – 100 ли	96.0

Чўчқа ошқозон ости безидан фосфолипаза А₂ ни ажратиб олиш қуйидаги тартибда олиб борилади: (150 г) ошқозон ости бези ацетон ва диэтил эфири билан ишлов бериш орқали ёғсизлантирилади. Олинган кукун масса бўйича 10 марталик NaCl эритмасининг 0.15 М ли миқдори билан 25⁰С да 16 соат давомида экстракцияланади, рН ини сульфат кислота орқали рН 4.0 гача етказилади ва 70⁰ С да 3 мин давомида иссиқлик жиҳатидан қайта ишлов берилади ва чўкмани центрифугаланади (6000 айл/мин, 30 мин). Чўкмаган суюқликни рН ини рН 7.5 гача етказилади ва 20 л дистилланган сувга қарши 24 соат давомида 4⁰С да диализланади ва центрифугалашгандан (18000 айл/мин, 30 мин) сўнг супернатант лиофил қуритилади. Олинган фосфолипаза А₂ препарати биоспецифик адсорбцион хромотография учун қўлланилади.

Фермент препаратини (200 мг) 0.1 м трис – HCl – буферида рН 8.0 да эритилади ва биоспецифик адсорбент билан тўлдирилган (айнан шу буфер билан тенглаштирилган) колонкага (180х10 мм) солинади. Адсорбентга ўхшаш бўлмаган балласт оқсиллари колонкани дастлабки буфер билан ювиш орқали йўқотилади. Ферментнинг адсорбент таркибидан элюцияси тритон Х-100 нинг 0 дан 0.1 % гача концентрация градиенти орқали амалга оширилади (40 – 41 мл). Кобра заҳаридан олинган фосфолипаза А₂ ни тозалаш (50 мг), чўл қора илонидан (44 мг) ва катта қовоғари (18 мг) дан олинган фосфолипаза А₂ ни тозалаш қуйидагича олиб борилади: заҳарли 0.5 М натрий хлорид эритмасини тутувчи 4 мл 0.01 М трис – HCl – буферида рН 8.0 да эритилади ва колонкага (100х10 мм) биоспецифик адсорбентнинг қуруқ массасига 4.0 г ҳисобида солинади (ушбу буферда тенглаштирилган). Адсорбция ва охирги операциялар тезлиги 4 мл/соат, температура эса 5⁰ С. Балласт оқсилларни йўқотиш учун колонкага 80 мл дастлабки буфердан қуйилади. Ферментнинг адсорбент таркибидан элюцияси тритон Х-100 нинг 0 дан 0.1% гача концентрация градиенти орқали амалга оширилади (80–80 мл).
Ферментлар биоспецифик хромотографияси методини ишлаб чиқиш масаласининг мувафаққиятли кўплаб омиллар орқали аниқланади: эримайдиган боғланишни тўғри танланиши; текширилаётган фермент деградациясига, шунингдек, тозалаш ва регенерация жараёнидаги юзага келиши мумкин бўлган қатъий шартларга адсорбентнинг барқарорлиги; фермент сорбцияси ва десорбцияси оптимал шароитларининг аниқланишининг аниқлиги.
Ушбу ишда биоспецифик адсорбентни ишлаб чиқиш учун эримайдиган ташувчи сифатида кукунсимон полиамид (капрон) ишлатилган. Бу ҳозирги кунда кенг тарқалган бошқа турдаги полисахарид ташувчиларидан зарур талабларга жавоб беради ва қатор афзалликларга эга: етарли даражадаги мустаҳкамликка эга; турли хромотографик формаларни бериш мумкин; механик ва кимёвий жиҳатдан мустаҳкам; чегараланган кислотали гидролизда кимёвий жиҳатидан осон фаолланади; микроорганизмлар ва ферментлар томонидан ҳужум қилинмайди. Биоспецифик лиганд сифатида фосфолипазаларнинг асосий субстратларидан бири – фосфатидилэтаноламин танланган. Лиганднинг ташувчи билан ковалент боғланиши глутар альдегидининг бифункционал боғланиши ёрдамида амалга ошади, бу эса ташувчининг сиртидан лигандни йўқотиш имконини берди, шу билан бирга: унинг ажратилган ферментлар билан боғланишидаги стеристик омиллар таъсирини камайтиради.
Лиганднинг бирикишидан сўнг эркин ҳолатда қолган ташувчининг альдегид гуруҳлари нейтрализацияси ортиқча этаноламинни қўшиш орқали амалга оширилади, бу эса эритмалардаги сорбентларнинг гидратланишини ошириш имкониятини ҳам беради.
Биоспецифик хромотография ўтказиш шароитларида А₂ фосфолипазалар таъсири остида иммобилланган фосфатидилэтаноламиннинг (лиганднинг) энзиматик ёйилиши ҳақидаги саволлларга жавоб бериш учун назорат тажрибалари ўтказилади. Етарли миқдорда А₂ фосфолипаза тутувчи эритмадаги адсорбентнинг инкубациясида бу фермент ишининг оптимал шароитларда (рН 8,5, 40⁰ С, 10 мМ Са²⁺) лиганднинг ёйилиши кузатилмайди: иммобилланган лиганднинг гидролизланмаслигини фосфолипаза А₂ нинг фосфолипидлар билан бирикишини маълум иккинуқтавий боғланиш гипотезаси асосида тушунтириш мумкин. Бунда каталитик босқичнинг пайдо бўлиши учун ферментнинг фаол марказидаги манфий зарядланган фосфат гуруҳлари ва гидролизланувчи эфирларнинг аниқ қайд қилиниши талаб этилади. Турли манбалардан олинган А₂ фосфолипазанинг нисбий субстратли спецификлиги бу гипотезанинг тўғрилигидан далолат беради. Фосфолипидлар аминоспиртли қисмининг кимёвий структураларининг сезиларсиз ўзгаришлари ҳам ферментнинг каталитик хусусиятларининг пайдо бўлишида сезиларли даражада таъсир кўрсатади. Барча холатларда эксперементал жиҳатдан исбот этилганки, фосфотидилэтаноламин аминоспиртли қисмининг полимерли ташувчи билан боғланиши лиганднинг гидролизланмаслигига олиб келади. Олдинроқ шу нарса ҳам аниқланганки, аминогуруҳ бўйича узун занжирли альдегидларнинг модификацияси субстрат реакцион қобилиятининг фосфолипазага нисбатан пасайиши билан тушунтирилади.
Турли омиллар таъсирининг ўрганилиши: ҳарорат (50⁰ С гача), юқори ион кучлари (3 М КCl), дитергентлар (1 % тритон Х–100, 0,1 % цетил триметил аммоний бромид), мочевина (8 М гача), диметисульфоксид (30 % гача) шуни кўрсатадики, бу шароитларда лигандлар боғланишининг барқарорлиги – қўйиш – ташувчи ва тўсувчи – қўйиш – ташувчи да бузилишлар содир бўлмайди.
Чўчқа ошқозон ости бези ва кобранинг заҳаридан ажратилган фосфолипаза А₂ адсорбциясининг оптимал шароитларини аниқлаш бўйича тажриба натижалари 5-жадвалда келтирилган. Ферментнинг фосфолипидли лиганд билан сезиларли босқичдаги комплекс ҳосил қилиши сувли эритмада содир бўлади, кальций ионларининг қўшилиши боғланаётган фермент миқдорини максимумгача ортишига олиб келади. Панкреатик фосфолипаза А₂ нинг активатори ҳисобланувчи натрий дезоксихолатнинг эритмада иштирок этиши шарт эмас. Юқори ион кучга эга эритмадан ферментнинг адсорбцияланиши шундан далолат берадики, фермент–лиганд комплекснинг ҳосил бўлишида фосфолипиднинг ёғ кислотали қолдиқлари ва фосфолипаза А₂ нинг гидрофоб участкалари орасидаги гидрофоб боғланишлар ҳал этувчи роль ўйнайди.
Фосфолипаза А₂ нинг биоспецифик адсорбент билан боғланган десорбциясининг турли вариантларини ўрганиш бўйича тадқиқот натижалари 6-жадвалда келтирилган. Адсорбентнинг детергентлар ва мочевина эритмалари билан бир марталик ювиш боғланган ферментнинг сезиларли миқдордаги десорбциясига сабаб бўлди, бу эса биоспецифик адсорбциядаги А₂ боғланишининг ҳал қилувчи ролини тасдиқлайди.
7-расм ва 7-жадвалда чўчқа ошқозоности бези, илонлар заҳридан динамик шароитларда биоспецифик хромотография методи ёрдамида олинган фосфолипаза А₂ ни тозалаш учун синтезланган адсорбентнинг қўлланилиш натижалари келтирилган.
Панкреатик фосфолипаза А₂ препарати оқсилларининг асосий қисми (7а-расм) колонка бўйлаб тутилмасдан ўтади ва фосфолипаза фаоллигига эга эмас. Колонканинг тритон Х–100 (0–0,1 %) концентрация градиенти билан ювилиши фосфолипаза А₂ нинг адсорбентдан тўлиқ элюциясини таъминлайди, полиакриламид гелидаги натрий додецилсульфат иштирокидаги диск–электрофорез натижалари бўйича аниқланган панкреатик фосфолипаза А₂ нинг молекуляр массаси 13500 ни ташкил этади.