Аффин хромотографияси

4 – жадвал
Турли ўсимликлардан ажратилган фосфолипазани тозалаш

Фосфолипаза манбаи	Тозалаш босқичи	Оқсил, мг	Фаоллик		Фаоллигига қараб чиқиши %	Тозалаш даражаси
			Умумий бирлик	Чегаравий бирлик / мг оқсил
Туруп илдизи	Бошланғич экстракт	5112	818	0.16	100	1
	Ацетон билан чўктириш	267	386	1.38	45	8.6
	Биоспецифик хромотография 1 форма 2 форма 3 форма	5.23 1.84 1.89 1.50	276.6 100.3 88.1 88.2	- 54.5 46.6 58.8	33.8 12.3 10.7 10.8	- 340 290 370
Пахта чигити	Бошланғич экстракт	320	12.8	0.04	100	1
	Ацетон билан чўктириш	44	7.7	0.18	60	4.4
	Биоспецифик хромотография 1 форма 2 форма 3 форма	0.35 0.11 0.10 0.14	4.0 1.2 0.9 1.9	- 11.6 8.6 13.2	31.6 9.6 7.3 14.7	- 290 215 320
Карам барглари	Бошланғич экстракт	700	92.0	0.13	100	1
	Ацетон билан чўктириш	36	39.6	1.10	43	8.5
	Биоспецифик хромотография 1 форма 2 форма 3 форма	0.68 0.21 0.22 0.25	26.6 8.8 6.5 11.3	- 41.0 30.0 45.5	29.1 9.6 7.2 12.3	- 315 230 350

адсорбцион хромотографияси методи юқори тозаланган кўринишда Д фосфолипазасининг 3 шаклини ажратишни ва бўлиш имконини беради (I, II, III шакллар); 3) I ва III шакл ўзининг каталитик хоссаларига қараб фарқланувчи фосфолипазанинг молекуляр факторлари эканлиги аниқланди; 4) олинган натижаларга қараб Д фосфолипазасининг хоссалари ҳақидаги баъзи адабий маълумотларнинг қарама-қаршиликларини тушуниш мумкин.


4.2 Фосфолипаза А₂ ферментини қора мол ошқозон ости безидан биомахсус усуллар билан тозалаш.
Фосфолипаза А₂ ферментини қора мол ошқозон ости безидан ажратишда, юқорида қўлланилган биомахсус усулни липолитик ферментларни тозалашда ҳам қўлласа бўлади. Шу сабаби, липолитик фермент препаратларида ҳам, нордон протеазалар мавжуд бўлиб, фосфолипаза А₂ ферменти эса дастлабки препарат таркибида зимоген ҳолатда бўлади. Ферментнинг фаол шакли, трипсин молекулалари таъсири иштирокида ҳосил бўлади. Яъни протеазалар ферментнинг нофаол ҳолдан, фаол ҳолга айланиши учун керак.
Шу сабабли протеолитик фермент молекулаларини, фосфолипаза фермент молекулалари билан ҳосил қилган комплексни, ажратиш жуда қийин. Яна шуни таъкидлаш жоизки, трипсин фосфолипазани фаоллаб бўлгандан сўнг ҳам, протеолизни давом эттиради, натижада фосфолипаза фаоллиги пасаяди. Шунинг учун фосфолипаза А₂ ферментини протеазалардан тозалаш, мақсадга муофиқ ҳисобланади. Бу ўринда шуни айтиб ўтиш лозимки, биферментли липосомал таҳлилда фосфолипаза А₂ муҳим аҳамиятга эга. Биз фосфолипаза ферментини иммун таҳлилда қўллаш учун, уни протеолитик ферментлардан тозалашни мақсад қилиб қўйдик. Шу мақсадда 2 хил сорбент синтезладик. Уларнинг бирида лиганд сифатида трипсин ингибиторини, иккинчисида фосфадитилэтаноламинни (кефалин) ишлатдик.
Бу икки сорбентларни навбат билан қўллаш, трипсинни олиб ташлаш ва тоза фосфолипаза А₂ ферментини олиш имконини яратади. Биринчи босқичда, синтезланган биринчи биосорбент қўлланилиб, ошқозон ости бези супернатантида трипсин йўқотилди.
Бунда сорбент, супернатант билан тўхтовсиз аралаштириш билан 12 соат давомида, 4⁰С ҳароратда инкубация қилинди. Инкубациядан сўнг, супернатант қайта фильтрланди ва трипсиндан ҳоли бўлган фосфолипаза А₂
олинди. Кейин, фосфолипазани тозалаш учун, 2-биомахсус сорбент яъни, фосфатидилэтаноламин билан синтезланган сорбент ишлатилди. Бу жараён ҳам инкубация қилиш йўли билан ўтказилди. Бунда комплекс ҳосил бўлиши, сувли муҳитда юз беради ва бу жараёнда кальций ионларининг иштироки шарт эмас. Бу жараёнда фермент десорбцияси, тритон х-100 концентрация градиенти орқали амалга оширилди. Бунда фермент препарати юқори ферментатив фаоллик билан, тўлиқ адсорбентдан элюирланди. Олинган натижалар 4-жадвалда келтирилган.
Жадвалдан кўриниб турибдики, фосфалипаза А₂ препаратининг фаоллиги 3,0 б/мгни ташкил қилади. Трипсин олиб ташлангандан сўнг, фермент фаоллиги ошди. Тозалашнинг сўнги босқичида, тозаланиш 213 мартани ташкил қилади. Бунда фермент 640 б/мг фаолликка эга бўлди. 4- жадвалда қавс ичида келтирилган маълумотлар, трипсинни олиб ташламасдан ўтказилган маълумотлар. Бунда фермент 380мг/б фаолликка эга
4- жадвал
Қорамол ошқозон ости безидан фосфалипаза А₂ ферментини тозалаш натижалари

№	Тозалаш боқичлари	Умумий оқсил миқдори, мг	Фаоллик		Тозаланиш даражаси, Марта	Оқсил ажралиши, %
			умумий б/мг	нисбий б/мг
1	Дастлабки препар. (гомогенат)	(2000) 2000	(6000) 6000	(3,0) 3,0	1	100,0
2	Ацетон ёрдамида чўк. 40%	(120) 135	(5400) 5350	(12,3) 13,8	(4,1) 4,6	(88) 86
3	1- биомахсус хроматография (диализ)	(92) 105	(2800) 3800	(30,0) 37,0	(10,0) 12,3	(62) 69
4	2-биомахсус хроматография	(10) 16	(2340) 3400	(390) 640	(130) 213	(0,5) 0,8

Изоҳ: қавс ичида кўрсатилган маълумотлар фосфалипаза А2 ферментини биомахсус сорбентларсиз тозалаш натижаларидир.

бўлиб, унинг тозалик даражаси 130 мартага тенг. Бу маълумотлардан кўриниб турибдики, фермент таркибидан трипсинни олиб ташламасдан тозалаш самарали эмас.

Шундай қилиб, ўтказилган тадқиқотлар шуни кўрсатдики, протеиназаларни биомахсус сорбция йўли билан олиб ташлаш, ферментларни тозалашда, энг самарали усул ҳисобланади. Буни услубни амилолитик, липолитик ферментларни тозалашда, шунингдек бошқа фермент препаратларини тозалашда ҳам қўллаш мумкин. 5-жадвалда турли манбаалардан ажратиб олинган, турли хил ферментларни тозалаш натижалари келтирилган.
Жадвалда келтирилган натижалардан, биомахсус храмотография усули билан тозаланган препаратларнинг ферментатив фаоллиги юқорилиги кўриниб турибди.
Шудай қилиб, биринчи марта липолитик фермент препарати протеазалардан махсус синтезланган сорбент асосида, биоспецифик хроматография усули ёрдамида тозаланди.