Аффин хромотографияси

2-жадвал
Қатор шартларнинг Д фосфолипазасини биоспецифик
сорбент билан бирикишига таъсири

Вариант номери №	Фермент адсорбциясининг шартлари	Боғланган фермент миқдори %	Элюирлашган фермент чегаравий фаоллигининг ошиши
1	0.05 М трис – HCl – буфер, рН 7.4	5	2.3
2	Таркибида 3мМ Са^2+ бўлган 0.05 М трис – HCl – буфер, , рН 7.4	8	2.7
3	0.05 М натрий - ацетат – буфер рН 5.6	23	1.5
4	Таркибида 30 мМ Са^2+ бўлган 0.05 М натрий - ацетатик – буфер рН 5.6	34	1.5
5	Олдинги шароитлар (вариант 4) лекин, охирги 1 М ли KCl қўшилиши билан	30	1.6
6	1,5 мМ адсорбентни қайта ишлаш билан 2 вариант шароити	24	2.6
7	1,5 мМ адсорбентни қайта ишлаш билан 4 вариант шароити	100	-
8	1,5 мМ адсорбентни қайта ишлаш билан 5 вариант шароити	100	-

Элюция шартларини танлаётганда маълум ҳолатлардан келиб чиқишади. Булар: гидрофоб ва электростатик таъсирлашишлар натижасида шаклланган оқсил мажмуаларининг мустаҳкамлиги тўғридан тўғри қуйидагича элюирлашаётган эритма параметрларига боғлиқ: ион кучи, ҳарорат. рН муҳит, лиганд билан мажмуалар яратишда рақобатлаша оладиган бирикмаларнинг эритмада борлиги. 8-тажриба шароити ва хона ҳароратида адсорблашган Д фосфолифазасининг элюция шартларини аниқлаш бўйича ўтказилган тажриба натижалари 3-жадвалда тақдим этилган. Кўриниб турибдики, колонкани бошланғич буфер билан паст ҳароратда ювилиши носпецифик гидробор таъсирлашишлар ҳисобига боғланган оқиллар десорбциясига олиб келади. Элюирлашаётган эритманинг ион кучи камайиши ва тизимдаги Ca²⁺ ни олиб ташлаши сорбентдан фермент элюциясини юзага келтирмайди. Фосфолипаза десорбцияси шунингдек, элюирлашаётган эритмага гидрофоб таъсирлашишларни пасайтириш хусусиятига эга юқори концентрацияли этиленгликоль ва глицерин қўшиш натижасида ҳам юзага келмайди. Фермент – лиганд мажмуани бузиш фақатгина рН муҳитни колонкани 0,05 М трис – HCl – буфер, рН 9,6 ювиш орқали кучайтириш натижасида эришиш мумкин. Мазкур факт шундан далолат берадики, электростатик кучлар тахмин қилганимиздек, фосфолипазани биоспецифик адсорбент билан боғлашда катта роль ўйнайди. 5-расмда турпнинг илдизларидан десорбция ва адсорбциянинг оптимал шароитларида олинган Д фосфолипазасининг аффин хромотографияси натижалари келтирилган. Расмда кўриниб турибдики, рН 5,0 да фосфолипаза Д сорбент билан бирикади. Бунда колонкага қўйилган ферментатив фаолликка эга бўлмаган оқсилларнинг катта қисми (95 % га яқин) колонкада ушланиб қолмайди. Чизиқли рН градиент элюциясида фосфолипаза фаолликнинг рН 6.8, 7.3 ва 8.0 чўққилари кўриниши десорблашади.