Аффин хромотографияси

4.1 Ўсимликлардан форфолипаза ферментини ажратиш ва аффин хроматография асосида тозалаш.

Д фосфолипазани ўсимликлардан (Ўрта Осиё шолғомининг илдизидан, пахта уруғидан ва карам баргларидан) умумий методика бўйича ажратиб олишади. Бу методика 0,05 М трис–HCl – буфер, рН – 8,9 оқсиллар ва –15⁰ С гача музлатилган икки баробар сиғими орттирилган ацетон экстрактидан олинган Д фосфолипазаси қуйқасини экстракциясидан ташкил топган. Қуйқани бидистилланган сувнинг минимал сиғимида эритишади, 15 дақиқа давомида 35000 g да центрифугирлаштирилади ва лиофил тарзда қуритишади. Олинган Д фосфолипаза препаратини биоспецифик хромотография учун ишлатишади.

Ферментнинг адсорбцияси ва десорбциясининг оптимал шартларини аниқлаш учун ўтказилган дастлабки тажрибаларда мутаносиб эритма буфер билан тенглаштирилган 2 гр ли биоспецифик сорбентнинг колонкасини (60х8 мм) ишлатишади. Фермент препаратини (560 мг) 3 мл тенглаштирувчи буферда эритишади ва колонкага пастдан тепага йўналишида қуйишади. Элюирлашаётган эритманинг сорбция ва кейинги турли элюирлашаётган эритмалар фермент десорбцияси пайтидаги ток (қувват) тезлиги барча ҳолларда 4 мл / ч га, ҳарорат 2⁰ С га, фракция сиғими 1,4 мл га тенг.
Д фосфолипазанинг препаратив аффин хромотографияси колонкада (180х10 мм) ушбу биоспецифик сорбентнинг 10 г билан, 50 мл 0.05 М натрий - ацетат буфер орқали, рН 5.6, 1.5 мМ ли DS – Na тутувчи 2 соат давомида 2⁰ да тинимсиз аралаштириш натижасида олиб борилади. 0.5 гр фермент препарати 10 мл 0.05 М натрий – ацетатли, рН 5.6, 30 мМ СаСl₂ ва
1 М KCl тутувчи буфер ёрдамида эритилади. Эримаган қисмини йўқотиш мақсадида (3000 g, 30 мин) центрифугаланади, чўкмаган суюқлик колонкага солинади.
Д фосфолипазасининг фаоллигини 65 % фосфотидилхолин ва 35 % фосфотидилэтаноламин аралашмасининг гидролизи тезлигига қараб аниқлашад. Қатор тажрибаларда субстракт сифатида хромотографик тоза фосфатидилхолин ишлатилади. Реакцион аралашма (умумий сиғими 2,5 мл) таркибида 12,5 мкМ фосфолипид, 125 мкМ CaCl₂, 200 мкМ натрий ацетатик буфер, рН 5.6, 0.1 мл 1мл га 0,043 – 0,054 мг оқсил концентрацияли фермент, 3,5 мкМ DS– Na бўлади. Инкубацияни 30 ⁰ С да 15 дақиқа давомида ўтказишади. Кинетик тажрибаларда компонентлардан бирининг консентрациясини ўзгартиришади. Ферментнинг максимал фаоллигини холинни мкмолда (Р₁) ёки 1 мг оқсил ҳисобида 1 дақиқада ҳосил бўлган эталоминда (Р₂) ифодалашади. Оқсилни спектрофотометрик метод орқали аниқлашган.
I фосфолипазанинг гель–фильтрациясини калибрлаштирилган молекуляр оғирлигига қараб С – 200 сефадексли колонкада (700х22мм) ёки М трис–HCl–буфер рН 7,5 да тенглаштирилган 0,01 С – 100 да ўтказишган. Ферментни колонкага 0,5 мл сиғимда қўйилади. Элюция тезлиги 8 мл/ч, фракция сиғими 2 мл дан, ҳарорат 2 ⁰ С.
Диск – электрофорезни полиакриламид гелида “Reanal” фирмаси (Венгрия) ускунасида ўтказишади. Фермент конфомерларининг изоэлектрик нуқтасини IKB (Швеция) амфолинларини ишлатган ҳолатда рН градиэнтда 3.5 дан 10 гача “Multiphol” (Швеция) ускунасида аниқлашади.
Фосфолипаза I нинг биоспецифик хромотографияси учун биоспецифик фосфотидилэтаноламин лигандини кукунсифат капронга ковалент бириктириш йўли билан олинган сорбентни ишлатишади.
Лигантни ташувчи билан боғлашни бифункционал бириктириш – глутар альдегиди ёрдамида амалга оширишади, лигантни қўшгандан сўнг эркин қолган ташувчини фаол гуруҳларини эса этаноламин билан чеклашган. Фосфатидилэтаноламиннинг максимал бириктириш 1,2–1,6 мкмоль фосфолипидларни 1 гр ташувчи мутаносиблигида амалга оширишган.
Буфер эритмаларни тайёрлаш учун трис (“Reanal”), сирка нордонли натрий, натрийтетраборинордон, тузли ва бери кислотасини ишлатишган, шунингдек, мазкур ишда DS–Na (“Сolenbrook Bucks” Англия), глутар альдегид (“Merck” ГФР), этаноамин (“Реахим” СССР) дан фойдаланишган.

Д фосфолипазасининг биоспецифик хромотографиясининг оптимал шартларини аниқлаш мақсадида ферментнинг сорбент билан бирикишига ва унинг турли элюирлашаётган эритмалар десорбциясига таъсир этувчи омилларни аниқлаш учун дастлабки тажрибалар ўтказилди, натижалар 1-жадвалда ва 1-расмда келтирилган. Кўриниб турибдики, рН 7,4 Ca²⁺ ҳам иштирокида, ҳам иштирокисиз Д фосфолипазасининг сорбент билан бирикиши аҳамиятсиз. Элюирлашаётган эритмада Ca²⁺ нинг борлиги қисман бириктирувчи фермент қисмини оширади. Фосфолипазанинг тўлароқ сорбциясини 1,5 мМ DS – Na сорбентининг дастлабки тозалинишида олиш мумкин эди. Маълумки, бу сорбент фосфолипазани активаторлари ичида энг самаралиси ҳисобланади, бироқ бунда энг яхши натижалар рН 5,6 натрий–ацетат таркибида 30 мМ Ca²⁺ ва 1 М KCl бўлган 0,05 М буфердаги фермент сорбциясидан олинган. Кўрсатилган шартларни танлашда Д фосфолипазасини мицелляр фосфолипидлар билан ўзаро таъсирлашишини ва Ca²⁺ ни жаарёнга таъсирини ўрганганда олинган натижаларни ҳисобга олиш зарур. Ферментнинг юқори ион кучга эга эритмадан сорблашиш имконияти шундан далолат берадики, фермент – лиганд мажмуасининг шаклланиши асосан гидрофоб таъсирлашиш билан исботланган. DS–Na сорбентининг дастлаб тозаланиши шартлиги шуни кўрсатадики, бу жараёнда, шунингдек, электростдик кучлар ҳам иштирок этади. Ca²⁺ нинг роли, тахминимизча ҳам сорбент юзасидаги ортиқча манфий зарядни нейтраллашиши, ҳам лиганднинг ионоген гуруҳлари ва фермент ўртасидаги боғловчи кўприк яратишга бориб тақалади.

Фермент билан боғланган сорбентда лигандни парчаловчи маҳсулотлар аниқланмаган (этаноамин ёки фосфатидил кислотаси). Бу ўз навбатида Д фосфолипазасининг каталитик таъсири намоён бўлиши учун фермент – субстракт мажмуаси юзага келиши учун қувватланган фосфолипиднинг спиртли қисмининг иштирок этишидир.