Аффин хромотографияси

А дан нордон протеиназни тозалаш.
Олдин ўтказилган тадқиқотлар томонидан адсорбцияланган альбумин ва желатина, таркибида нордон протеиназалари бўлган фермент эритмаларида инкубатлаштирилганда, ферментатив гидролизга учраши исботлаб берилган. Шунингдек, этанол бу жараённи секинлаштиради, унинг концентрацияси 20% ортиқрок муҳитда эса ферментатив жараён деярли кечмайди, лекин спиртнинг борлиги ферментни альбумин билан бирикишига кам таъсир кўрсатади.
А oruzae дан бир атомли спирт билан нордон протеиназаларнинг ингибирлаштириш орқали олинган тадқиқотлар натижаларининг кўрсатишича, унинг фаоллиги этанол борлигида пасайган (1-расм).
Тадқиқ этилаётган спиртнинг углеводород занжири қисмининг узунлиги ортиши билан уларнинг ингибирлаштириш таъсири кучаяди.

Спиртнинг миқдори, % ларда

1-расм. А даги нордон протеиназа фаоллигига бирламчи спиртларнинг таъсири. 1-метанол, 2-этанол, 3-н-пропанол, 4-н-бутанол, v₀-спирт бўлмаган ҳолда альбумин гидролизи тезлиги. v- худи шу турли миқдордаги спиртларнинг борлик пайтидаги ҳолати.

Бунинг натижасида хромотография шароитларида гидролиз субстратини ингибирлаштириш мақсадида ферментнинг адсорбцияси ва десорбцияси шароитларини танлаш учун барча тажрибалар сув – спирт муҳитида ўтказилади.
А. Oryzae даги нордон протеиназнинг биоспецифик сорбент билан бирикишдаги аҳамиятли таъсирни рН катталиги кўрсатади (2 - расм).
Нордон протеиназани оқсилли субстратларни сорсилен билан импергнирлаштирилгандан сўнг бирикиш даражаси рН 2.7 дан 3.5 гача максимал бўлади (2а – расмга қаранг).

Иммобилизациялаштирилган
фермент фаоллиги, бирлиги.

Эркин фермент

фаоллиги, бирлиги.

2- расм. рН муҳитни адсорбция (а) ва IM NaCl (б) таъсири остидаги
А. oryzae даги нордон протеиназнинг биоспецифик сорбент десорбцияси:
1– импергнирлаштирилган желатинли сорсилен; 2–альбуминли импергнирлаштирилган сорсилен.

Бундай шароитларда импергнираллашган альбуминли 1 гр сорсилен ферментнинг 3.4–3.8 бирликдаги фаоллиги билан бирикади, импергнираллашган желатинли 1 гр ташувчи эса 1.8–1.9 бирликдаги фаоллик билан 0.1 М NaCl сорбирланган фермент элюцияси вақтида кўрсатилиша, ферментнинг катта қисми рН муҳит 3.4–4.0 аҳамиятида дисорбирлашган бўлиши мумкин (2б-расмга қаранг). Фаоллик бўйича бу шароитлардаги чиқиш икки сорбент учун ҳам келтирилган ферментнинг умумий фаоллигидан 25–30 %ни ташкил этади.

Ундан сўнг элюирлаётган агент таркибидаги этанол ва хлорли натрий консентрациясини А. oryzae биоспецифик сорбентдаги нордон протеиназ десорбцияси жараёнига таъсирини тадқиқ этилади (3-расм).

а) этанол % б) NaCl, M

3-расм. Элюирланаётган эритма таркибининг А. oryzae даги нордон протеиназга таъсири: а) 0.1 М NaCl эритмадаги этанол; б) нордон протеиназнинг 20 % ли этанолидаги хлорли натрий: 1–сорсилен–желатин; 2–сорсилен–альбумин. А–этанол иштирокида дисорбирлаштирилган фермент фаоллиги; А₀–этанол иштирокисиз дисорбирлаштирилган фермент фаоллиги.

Нордон протеиназ десорбцияси 0,1 М NaCl элюцияда ўтиши мумкин. Бироқ бунда сорсилен – альбумин билан А₀ – 0,95 бир фаол.да дисорбирлашади, сорсилен – желатин билан эса - А₀ нинг бир. фаолдаги фермент ёки 22,5 % адсорбирлашган нордон протеиназнинг биоспецифик сорбентида мутаносиб. 3а-расмдан кўриниб турибдики, элюирлаётган агент таркибида 20 % этанолнинг борлиги сорсилен – альбуминдан фермент десорбциясини 1,2 мартага оширади, сорсилен – желатинда эса 1.8 мартага.
Фермент дисоциясига шунингдек, эритманинг ион кучи катталиги ҳам аҳамиятли таъсир кўрсатади. Берилган 3б-расмдан кўриниб турибдики, NaCl йўқлигида сорбентни 20 % ли этил спирти эритмаси сорбентдан 70 % дан ортиқроқ белласт оқсиллар олиб ташланганда ҳам нордон протеиназни десорциясига олиб келмайди. Ион кучини катталаштириш NaCl концентрациясида нордон протеиназ десорциясига ёрдам беради, 0.2-0.3 М қийшиқ дисорцияси ҳам сорсилен – альбумин тизимида қандай платога чиқса, сорсилен – желатинда ҳам шундай бўлади.
Биоспецифик тозалашдан сўнг олинган А. oryzae даги нордон протеиназ етарли даражада тоза (4-расм).


фракция сиғими, мл

4-расм. Гел– фильтрлаш сувли биоспецифик (а) сорбент ва сув–спиртли (б) эритмаларида элюирлашган G–100 сефедакс фракцияда: 1– оқсил таркиби, 2– А. oryzae даги нордон протеиназа фаоллиги.

У ягона сефадаксда гел – фильтрлашдаги чўққи билан элюирлашади, бунда оқсил чўққиси ва фаоллик чўққиси мос келади. Кўриниб турибдики (шунингдек, 3-расмга қаранг), 20 % ли этанол иштирокида десорбция жараёнларининг ўтказилиши ферментнинг тозалигига ижобий таъсир кўрсатади. Элюитда аниқланадиган қўшимчалар сони тозалаш этанол иштирокида ўтказилганда, анча пасайади (4б-расмга қаранг).