Аффин хромотографияси

4.6. Биомахсус хроматография усули билан коньюгатларни тозалаш.

Коньюгатларни биомахсус хроматография усули ёрдамида турли компонентлардан тозалаш ишларини олиб бордик. Олинган конъюгатларни тозалаш учун, аффин хроматография усулидан фойдаландик. Бунда юқорида қайд этилган биомахсус сорбентлардан қўлланилди. Ушбу ишда бизга 2 хил сорбент зарур бўлади. Бири антитанага специфик бўлса, 2-си эса α – амилаза фермент препаратига хосдир.

Иммуносорбент олиш учун антиген сифатида дифтерия токсини олинди ва иммуносорбент синтез қилинди. Биринчи босқичда антитана билан олинган 5 мл миқдордаги конъюгат эритмаси (1,5х2,5см 1,5г иммуносорбент тўлдирилган) колонкадан 2,5мл/соат давомида ўтказилди. Коньюгат сорбцияси ва ювилиши 25мМ CaCl₂ тутувчи 0,05М боратли рН 7,4 буферда амалга оширилди. Десорбция учун 0,05М трис буфер рН 7.4 ва 0,1М NaCl ишлатилди. Десорбция натижасида ҳосил бўлган барча фракцияларда, оқсил концентрацияси ва фермент фаоллиги ўлчанди. Ушбу босқичда, коньюгат фермент – фермент типидаги компонентлардан тозаланди. Бироқ, шуни таъкидлаш керакки, десорбциядан кейинги олинган фракциялар ҳам серологик ва ферментатив фаолликка эгалиги аниқланди. Ферментатив ва серологик фаолликга эга бўлган фракцияларни қўшиб дисстилланган сув ва 0.05М NaClга қарши диализлаб, кейинги тозалаш жараёни амалга оширилди.
Кейинги босқичда α – амилаза коньюгатини антитана – антитана типидаги коньюгатлардан тозалаш керак эди. Бунинг учун коньюгатларни бу комплекслардан халос этиш учун, 5 гр сувда эримайдиган крахмал олиб, колонкага жойлаштирдик. Шундан сўнг, аффин хроматография усули орқали конъюгат сорбцияси амалга оширилди. Бунда коньюгат сорбцияси ва ювилиши рН – 8,2 0,05М трис буферда ўтказилди. Элюция эса 0.1М дан 1.0 М натрий хлорда (рН 8.2 трис-буфер) амалга оширилди. Бу босқичда юқорида айтилганидек коньюгат антитана-антитана каби компонентлардан халос бўлди.
Натижалар шуни кўрсатдики, биомахсус хроматография усули билан тозаланган дифтерия токсинига қарши олинган антитанали α – амилаза коньюгати, фаолликка эга ва дифтерия токсини билан серологик реакцияга кириша олади. Биомахсус хроматография йўли билан коньюгатларни тозалаш натижалари шуни кўрсатдики, бундай усул билан тозаланган коньюгат, ферментатив фаолликка эга бўлгани билан, коньюгат чиқими юқори даражада эмаслиги маълум бўлди. Конъюгат чиқими 27,2% ташкил қилди. Шунга кўра кейинги босқичларда, коньюгаталарни тозалашда гель-хроматография усули қўлланилди.