Аффин хромотографияси

2.4. Аффин электрофорез
Полиакриламид гельдаги аффин электрофорез- бу ажратиш усули бўлиб, полиакриламид гелида электрофорез ва аффин xромотография устунликларидан фойдаланилади[23,24]. Микро масштабда бу усул оқсил аралашмаларини специфик аффин лигандга комплементар равишда иммобилланган боғловчи сохаларга эга бўлган компонентларни танловчан ажратиш орқали тахлил қилишга имкон беради. Сўнгилари полиакриламид гели матрицасининг бир қисми билан ковалент боғланган бўлиб, шу тарзда “аффин гель ” нинг қатлами ҳосил бўлади. Ушбу усулнинг мохияти, аффин электрофорез ёрдамида фаол оқсилларни бўлишнинг типик мисоли сифатида 7.4 расмда яxши кўрсатилган. Диаметри тенг бўлган шиша найчаларада 3 қатламли полиакриламид гели тайёрланади: йирик ғовакли гель (А): N, N¹ метиленбисакриламидни тикувчи агент сифатида қўллаш орқали акриламид билан алкенил-О-гликозидларни сополимеризацияси орқали олинадиган аффин гель (D); кичик ғовакли гель (B). Иккита А ва Б қатламларидан (1 найга) ташкил топган стандарт гель назорат сифатида қўлланилади. Иккинчи найга О-α-D галоктопиранозали полиакрикамид сополимеридан ташкил топган гельни, 3-найга эса О- α -D-маннозали полиакриламид сополимеридан ташкил топган гельни тутади. Нўхатдан ажратиб олинган оқсил фракцияси (Disum sativum L.), гемагглютинловчи компонентини тутади. Бу компонентлардан бирортаси ҳам, 2-найчадаги α -0-галоктозил структурали аффин гель билан комплекс ҳосил қилмайди, бу ўз навбатида 1 ва 2 найчалардаги бўлинишнинг электрофоретик ўxшаш манзарасида акс этган. Бироқ шу компонентлардан иккитаси фитогемагглютининлар ҳисобланиб, 3-найчадаги аффин гельнинг α -D-маннозил структураси билан ўзаро таъсиралшиб, ингичка чизиқ кўринишида 3-найчанинг бошида аффин гель томонидан тутиб қолинади. Аралашмадаги қолган 3та оқсилнинг харакатчанлиги қолади, бунга майда ғовакли (B)гельдаги оқсил йўмларини тарқалиши гувохлик бериб турибди.
Аффин xромотографияга ўxшаш бўлгани каби гельдаги аффин электрофорезни оқсил-лиганд комплексларининг диссоциацияси константасини аниқлашда қўллаш мумкин. Усул мохияти берилган оқсил харакатчанлигининг гелдаги боғланган лиганднинг консентрациясига боғлиқлигини ўрганишдадир. Ушбу лиганд гель билан ковалент боғланган ёки эндигина гельга қўшилган бўлиши мумкин. Электрофорезнинг бундай илк маротаба қўлланилиши Такео ва Накамура [50] томонидан ёзиб қолдирилган: фосфорилаза-полисаxарид комплексларининг диссоциация константалари, ковалент боғланган полисаxаридни турли консентрацияларини тутган полиакриламид гелидаги электрофорез ёрдамида аниқланди. Бегxансен [9] зардоб гликопротеинлари билан конканавалин А комплексларини диссоциация консталарини аниқлаш учун конковалин А билан ковалент боғланган сефарозадаги электрофорезни қўллаган.
Аффин электрофорез мохияти нафақат лиганд билан боғланган оқсил комплексларининг диссоциация константаларини аниқлаш учунгина, балки, эркин лигандлар билан боғланган комплексларнинг диссоциацияси константаларини аниқлаш учун ҳам қўлланиши мумкин. Аффин ташувчидаги электрофорез жараёнида оқсил сохасининг харакатчанлиги эркин специфик лиганднинг консентрациясига боглиқ. Шундай қилиб лектин-қанд комплексларининг диссоциация константалари аниқланади[64].
Қанд тутувчи сорбентни тайёрлаш учун акриламид, N, N¹ - метилбисокриламид ва аллилгликозидни полиакриламид гели билан сополимерланади. Қолган мономерли аллилглукозид олиб ташланади, гель эса буфер эритма билан мувозанатлаштирилади,унда электрофорез олиб борилади ва яна найчага қайта киргазилади. Аллилглюкозидли акриламиднинг эрувчи сополимерини тайёрлаш теxник жихатдан осондир. У лиофил тарзда қуритилган бўлиб, маълум миқдорда қанд тутади ва маълум молекуляр массага эгадир. Маълум миқдорда боғланган қандли қанд тутувчи полимерни зарур миқдорда полимерланувчи аралашмага қўшилади.
Бундан ташқари, эркин қанднинг берилган миқдори полимерланувчи аралашмага қўшилади ва гель полимерланиши учун қолдирилади. Бундай усул билан боғланган қанднинг доимий консентрацияси ва эркин қанднинг ортиб борувчи консентрацияли гель найчаларининг топлами тайёрланади.
Ушбу усул билан тайёрланган геллардаги лактинларнинг ўлчанган харакатчанлик боғлиқлиги қийидаги нисбатга бўй синади.

Бунда К_i- богланган қанд-лектин комплексининг диссоцияланиш константаси; К-эркин қанд-лектин комплексининг диссоцияланиш константаси; C_i- боғланган қанд консентрацияси; C-эркин қанд консентрацияси; i- берилган C_i ва C да пектин харакатчанлиги; i₀- боғланган қанд билан ўзаро таъсири йўқлигида пектин харакатчанлиги.

Бу нисбат аффин xромотография ёрдамида диссоциация константаларини аниқлаш учун Данн ва Чейкен томонидан келтириб чиқарилган тенгламдан тўғри келиб чиқмоқда.
Деярли барча ҳолатларда К_i К дан паст бўлган (5-10 мартагача), бу шундан далолат берадики, барча барча тадқиқ этилган пектинлар бир нечта боғлаш марказларига эгадирлар. Аффин электрофорезни қўллаган ҳолда, нисбатан юқори диссоцация константаларини аниқлаш мумкин.
Аффин электрофорез диссоцация константаларини аниқлаш қуйидаги қулайликларга эгадир:
а) xаттоки гомоген бўлмаган модданинг кичик миқдори.
б) Намунадаги мавжуд ўрганилаётган лиганд билан ўзаро таъсирлашувчи электрофоретик фарқланувчи компонентларнинг К_i ва К ни бир вақтнинг ўзида аниқлаши.
в) барча С ва С_i учун чизиқлар кескин ва уларни жойлашувини осон аниқлаш мумкин.
г) усулнинг тезлиги, лабаратория ускуналарининг оддийлиги, бир вақтнинг ўзида катта миқдордаги намуналарни тахлил этилиши.
д) К ва К_i нинг кенг диапазони; юқори К ларни аниқлаш имкони.
Бу усул яна бошқа оқсилларни специфик лигандлар билан ўзаро таъсирини ўрганиш учун ҳам фойдалидир.