Аффин хромотографияси

PL Biochemicals фирмасининг аффин сорбентлари

Лиганд	Сорбент препаратининг номи	Лиганд миқдори	Биринчи усули	Сақлаш усули
Кофермент			Карбамидни қўллаган холда агароза-капрон кислота билан СоА реацияси	-250С 50% глицеринда
			Агароза-капрон кислотанинг N-оксисукцинимид эфири билан CоА реакцияси	0,02% азид натрий тутган суспензия шаклидаги, 4^0C да
			Корбамидни қўллаган холда, агароза-капрон кислота билан NAD реакцияси	-25^0C да 50% ли глициринда
Лектин			Агароза богълашдан олдин, гексаметилендиамин НАД га аденин Ц8 холатида богъланган	Худди шу
Нуклеин кислота			Гидрозидни кейинги боғланиши билан борадиган, рибозанинг периодатли оксидланиши	>> >>
			Худди шу	>> >>
Нуклеозид			Бромциан билан фаолланиш	0,02% азид натрий тутган суспензия шаклидаги, 4^0C хароратда
			4%-агароза киритилган, бузоқ тимусининг денатурациланган ДНК си	4^0Cда суспензия шаклида, 0,01М трис HCl(пХ7,5) +1,0М NaCl +1мМ ЭДТА +0,02% ли азид натрий тутади
Нуклеотид			Целлюлоза адсорбцияланган бузоқ тимусининг натив ДНК си	Худди шу
			Агароза боғланишидан аввал гексаметилендиамин аденозинга аденин С^8 холатида бириккан	4^0С да, суспензия шаклида, 0,02% азид натрий тутади
			Агароза боғланишидан аввал гексаметилен диамин 2^1,5^1-АДФга пурин 6-холатда боғланган	Худди шу
			Агароза боғланишидан аввал гексаметилен-диамин 3^1,5^1-АДФ пурин 6-холатда боғланган	>> >>
			Гидрозидни кейинги боғланиши билан борадиган, рибозанинг периодатли оксидланиши	>> >>
			Агароза боғланишидан аввал гексалометилен-диамин сАМФга аденин С^8 холатида боғланган	4^0Сда сус-пензия шак-лида 0,02% азид натрий тутади

4 Боб Янги биомахсус сорбентлар олиш ва уларнинг
ишлатилиш йўллари.

Замонавий биотехнология бугунги кунда шиддат билан ривожланиб бормоқда. Айниқса, аналитик биотехнология йўналишида пайдо бўлаётган иммуноэнзим таҳлилининг липосомалар ёрдамида амалга ошириладиган усули, шубҳасиз алоҳида ўрин тутади. У ҳозирги кунда биокимёда, ташхиз қилиш услубларини ривожланишида муҳим аҳамиятга эга. Иммуноэнзим таҳлили (ИЭТ) моҳияти шундан иборатки, бунда иммунологик реакция компонентларидан бири, антиген ёки антитаналар кимёвий ўзига мос фермент билан боғланади ва иммунокимёвий реакцияга фермент субстрати таъсир эттирилади, шундан сўнг эса, реакция маҳсулоти ҳосил бўлади. Буни осонгина кўриш ёки қулай йўллар билан ўлчаш мумкин. Фермент жуда юқори каталитик фаолликка эга бўлганлиги учун (10^-9-10^-10М), фермент билан нишонланган иммун комплекси ёрдамида, антигенни қисқа муддат ичида аниқлаш мумкин бўлади.

Бунинг ҳаммаси ИЭТ услубининг юқори сезувчанлигини ва аниқ таҳлилини таъминлайди. Замонавий ИЭТ услублари билан радиоиммунологик (РИА) ва иммунофлюоресцент таҳлили (ИФТ) услубларини қиёслаш мумкин. Бироқ, бу усулларни ҳар доим ҳам қўллаб бўлмайди, негаки, улар ИЭТ дан фарқлироқ қимматбаҳо ва алоҳида махсус асбоб-ускуналарни талаб қилади.
Шунингдек, аксарият ҳолларда, амалиётда “сэндвич” принципига асосланган услублар қўлланилади. Гарчи, ИЭТда бошқа принципларга асосланган услублар мавжуд бўлса ҳам, энг оддий ва енгил принцип - титрлаш принципидир. Бу ёндашув асосан кислота - ишқор услубини эслатади. Бунда эритмада мувозанат бўлгандан сўнг, ишқор ёки кислота миқдори ошиши билан эритма муҳити яъни рН ўзгаради.
Худди шундай иммунокимёвий реакциядаги фермент томонидан белгиланган компонентлар, эритмада ферментатив фаолликни юзага келтиради ва эквивалентлик нуқтаси бўйича, таҳлил қилинаётган компонент аниқланади. Рақобат принципига асосланган усулда эса, фермент билан нишонланган антигенлар ёки антитаначаларнинг нишонланмаган компонентлари, иммунокимёвий реакцияда рақобатлашади. Оддий, лекин самарали услублардан яна бири, бу ИЭТ ни экранлаштириш усулидир.
Бу усул шунга асосланганки, бунда белгиланган фермент ўрнига алоҳида макромалекуляр субстратларга таъсир қилувчи ферментлар танланади. Масалан, фосфолипазалар фақат фосфолипид ҳосилаларга таъсир қилади. Бу усул йирик антигенлар билан яхши натижа беради. Масалан, вируслар, хужайралар в.х.
Таҳлил қилинаётган эритмага қўшилган антитаналар, у ердаги антигенлар билан бирикади. Бунда антигенларнинг бир қисми ортиб қолади.
У малекуляр субстрат билан таъсирланиши натижасида, ковалент боғланган фермент малекулаларини экранлаштиради. Экранлаштирилмаган бир қисм ферментлар, субстрат билан таъсирланиш қобилятини сақлаб қолади. Бу эса, таҳлил қилиш имконини яратади. Шунингдек, ҳозирги вақтда ИЭТни мукаммаллаштириш бўйича тадқиқотлар олиб борилмоқда. Олиб борилаётган илмий тадқиқот ишлари таҳлилнинг юқори даражада аниқ, сезувчан бўлишига қаратилган. Бу ўринда шуни айтиб ўтиш керакки, ушбу диссертация ишининг мавзуси долзарб масалага, яъни сезувчанлиги юқори бўлган, замон талабига жавоб бера оладиган бифермент усулини ишлаб чиқишга ва мавжудларини янада такомиллаштиришга қаратилган. Шу сабабли ИЭТ амалиётига янги сорбентларни киритилиши, услуб сезувчанлигини янада ошириш имконини яратади ва бу эса ўз навбатида биологик сорбентларни ва улар асосида биоспецифик иммуносорбентлар синтез қилиш лозимлигини тақозо этади.
Ҳозирги кунда ИЭТ даги асосий муаммолардан бири, нишон сифатида қўлланиладиган ферментларга боғлиқдир. Ферментларни ҳаммасини ҳам ИЭТда нишон сифатида қўлласа бўлмайди. Сабаби, ИЭТ қўлланиладиган ферментлар бир қатор талабларга жавоб бериши керак. Ана шу талаблардан бири, ферментларнинг тозалик даражаси ҳисобланади. Бу ўринда шуни айтиб ўтиш лозимки, нишон сифатида қўлланиладиган ферментларнинг таркибида кўпинча протеолитик ферментлар мавжуд бўлиб, улар нафақат асосий ферментларга, шунингдек антитаналарга ҳам, иммункомплексларга ҳам салбий таъсир кўрсатади. Бу эса ўз ўрнида, таҳлил қилинаётган синамаларда якуний таҳлил натижаларини бузилишига олиб келади. Шу сабабли, ферментларни протеазалардан тозалаш муаммоси, энг долзарб муаммолардан бири ҳисобланади. Яна муҳим муаммолардан бири, коньюгатларни синтез қилиш услубларини ишлаб чиқишдир. Бу ерда янги ишланмалар устида тадқиқот ишларини олиб бориш талаб этилади.
Шуни таъкидлаш лозимки, ИЭТ да янги замон талабига жавоб берадиган липосомал бифермент таҳлилини ишланиши, ҳозирги кунда ИЭТ устида илмий изланишлар олиб бориш долзарб муаммо эканлигини кўрсатади.
Ҳозирги кунда сезгирлик даражаси юқори бўлган иммуноэнзим таҳлили (ИЭТ) турли соҳаларда муҳим ўрин эгалламоқда. Жумладан, тиббиётда ташхиз қилишда, биологик фаол моддаларни аниқлашда, қишлоқ хўжалигида, ветеринарияда в.ҳ. ИЭТ кенг қўланилганлиги сабабли, амалиёт ИЭТ ни янада такомиллаштиришни ва шу билан бирга унинг янги услубларини ишлаб чиқишни тақозо этмоқда. Биринчидан, ИЭТда нишон сифатида қўлланиладиган ферментлар турли кислоталар, юқори температура, ингибиторлар, органик моддалар ва шунингдек, протеолитик ферментлар таъсирида денатурацияланиши анчадан бери маълум [Самуилов, 2001]. Юқорида қайд этилган омиллар ва протеазалар ИЭТ да қўлланиладиган ферментларга, антитана, антиген ва конъюгатларга салбий таъсир кўрсатади. Бундан ташқари, ҳозирги кунда сезгирлик даражаси юқори бўлган иммун таҳлилларни ишлаб чиқиш мақсадга мувофиқ ҳисобланади.
Ушбу бобда амилолитик ва липолитик фаолликка эга ферментларни тозалашнинг самарали услубларидан бири, яъни юқорида қайд этилган аффин хроматография асосида тозалаш ва шу билан бирга биоспецифик сорбентларни синтехлаш жараёнлари келтирилган. Асосий диққат махсус синтезланган сорбентларга, хусусан янги биомахсус хроматография усули ёрдамида, турли фермент препаратларини тозалашга қаратилган. Шу билан бирга протеолиз жараёни гидролитик ферментларни барқарорлигига салбий таъсир кўрсатиши, биринчи марта ишонарли қилиб кўрсатилган.
Кўп ҳолларда нордон протеазалар, шунингдек трипсин ва бошқа протеолитик ферментлар, ферментларнинг фаоллигини пасайишига ва иммун компонентларга салбий таъсир кўрсатиши, тадқиқот натижалари асосида олинган маълумотларда кўрсатилган. Бундан ташқари ушбу ишда, махсус яратилган биоспецифик сорбентлар, нафақат ферментларни протеазалардан балки, бу йўл билан ИЭТ компонентларини ҳам антипротеолитик ҳимоялаши кўрсатилган. Биринчи марта, вирусли ва бактерия антигенларига қарши олинган антитаналар билан амилолитик ва липолитик ферментлар коньюгатлари олинган ва уларни физик-кимёвий хусусияти ва иммунологик фаоллиги ўрганилган.
Гель – хроматография усули билан коньюгатларни тозалаш услуби таклиф қилинган. Дифтерия токсинига антитана коньюгатларини олишнинг энг оригинал ёндошув усули яратилган. Нишон сифатида қўлланилган амилаза ферменти билан, конъюгат синтез қилишнинг йўналтирилган ва мўлжалланган усуллари ишлаб чиқилган. Ана шу мақсадда ва турли антиген, антитаналарни тозалаш учун иммуносорбентлар синтезланган. Антитаналарни сорбентларга сорбция ва десорбция қилиш шароитлари ўрганилган ва келтирилган.
Турли сорбентлар хроматорграфияда қўлланилишида ва бошқа турли хил мақсадларда ишлатилганлиги сабабли, биосорбентлар синтези устидаги изланишлар ҳозирги кунда ҳам давом этмоқда. Сорбентларни турли хил мақсадларда, кенг доирада қўллаш мумкин, масалан:

• 
  гетероген ИЭТни ўтказишда антиген ва антитаналарни иммобилланган ҳолатга ўтказишда ва коньюгатлар синтезида, турли хилдаги биотехнологик жараёнларни амалга оширишда;
  
• 
  тозаланган ҳолатда иммунокимёвий реакция компонентларини олиш учун; бунда ҳаммага маълум сорбентлар ишлатилади ва шу билан бирга биологик маҳсус (аффинлик хусусиятига эга бўлган) сорбентлар яратилади.
  
• 
  янги авлод сорбентлари протеазаларни селектив йўқотиш учун;
  
• 
  ҳозир кун талабига жавоб бера оладиган, бир неча афзалликларга эга сорбентлар синтез қилиш ва уларни ИЭТ усулларини такомиллаштириш мақсадида қўллаш.
  

Тоза фермент препаратларини олишда, ИЭТни турли усулларида қўлланиладиган ва шу билан бирга бошқа мақсадда қўлласа хам бўладиган биомахсус сорбентлар синтез қилинган. (Ушбу сорбентлар 1-жадвалда келтирилган).