Аффин хромотографияси

Антитаналар ва уларга специфик бўлган антигенлар

Антитаналар антигенларга хос специфик моддалар ҳисобланади. Улар асосида ҳосил юўлган комплексларни ажратиш қийин кечади. Бу ҳолат айнан икккала компонентни ўзаро таъсир кучи катталиги билан изоҳлаш мумкин. Иммуно диффузион xроматографияда кучли xоатроп элиюантлардан фойдаланмасликни бир йўли, бу иммобилланган аффин компонентларни кимёвий модификациясидир. Масалан, колонкадаги глюкогон моддаси иммобилланган антиглюкогон антитаналарни эллюирланиши нисбатан юмшоқ шароитларида олиб борилиши мумкин. Қачонки, боғланаётган модда билан антитананинг боғланувчи қисмини фазовий комплементарлиги бузилса, ушбу холат реакция самарадорлигига таъсир кўрсатади. Шу сабабли ушбу тузилмалар аффин хроматографияда муҳим роль ўйнайди.

Аффин тузилмаларни унча катта бўлмаган лиганд ва макролигандларга бўлиш мумкин. Сабаби, улар асосида уларни ўзаро фарқлаш мумкин бўлади. Шу сабабли, паст малекуляр синтетик лигандлар ўзининг киришимлилиги ва турғунлиги билан афзалроқ ҳисобланади Улар асосида таёрланган специфик сорбентлар одатда яxши боғланган бўлиб, ушбу лигандлар ташувчига маълум функционал гуруxлар билан бириккан бўлади.Ушбу лигандларнинг стерик киришимлилигини яxшилаш учун фаол гуруҳлар киритилади, кўпгина ҳолларда ушбу гуруҳлар лиганд ва эримайдиган ташувчи юзаси ўртасида бўлади. Юқори малекуляр аффин лигандлар сифатида оқсил ёки нуклеин кислоталардан фойдаланилади.Улар кўпинча денатурацияга учраши туфайли фаоллигини йўқотиб, қайта тикланмайди. Шунинг учун уларни ташувчига бирикиш усули юқори натижа бермайди.


Ферментлар, ингибиторлар ва кофакторларни ажратиш.
Ферментларни ажратиш учун аффин лигандлар сифатида конкурент ингибиторлар, субстратлар ва уларнинг кофакторлари ва аллостерик эффекторлар, ёки антитаналар xизмат қилиши мумкун. Конкурент ингибиторни қўлланишини мисол сифатида ошқозон ости безининг тозаланган экстрактидан xимотргипсинни ажратиш мисолида кўриш мумкин. специфик сорбент сифатида гексаметилсндиамин орқали бирикан Н-бензилоксикарбонил пицил-D-фенилаланин қўлланилган. Ферментни илюирлаш pH ни ўзгартириш йўли билан ёки трипсининг конкурент ингибиторининг специфик эритмаси ёрдамида амалга оширилади .
Трипсининг эрувчи ингибитори билан ҳосил қилган поликомплекс xимотрипсининг фокфешири учун қўшимча равишда кислатали муҳитда гел- xраматографияни қўллаш мумкин. Натижалар (xимотрипсин миқдори ва фаолиги) 2 матерални оддий лиофил қуритиш жараёнида олинган натижалар билан деярли мос тушади.
ДНКни аффин хроматография асосида тозалашда унга нисбатан специфик бўлган бир занжирли ДНК ни субстрат ёки аффин лиганд сифатида қўллаб, амалга ошириш мумкин. Масалан, ДНКга - агарда бирор органик табиатли сорбент энг самарали xисобланса, ушбу сорбент ДНК нинг юқори канцентратцияси билан тўйиниб, унда олиб борилган носпецифик сорбция энг кам миқдорда бўлади. Фемантларни ажратишда субстратларни қўллашга яна бир мисол, бу цитохром С иммобилланган сефаразадаги цитоxрамоксидазанинг ва биогенли, карбоксиметилланган коллаген билан тартибли механизмда лиганд А ва лиганд В ни ҳосил қилиши ва иккиламчи комплекс билан таъсирлашишидан амалга ошадиган жараённни айтиб ўтиш мумкин.
Тартибсиз меxанизмда А ва В лигандлар бир-бирига боғлиқ бўлмаган холда турли тартибда боғланишлари мумкин. Бу ҳолда лигандни танлаш фермент билан ўxшаш бўлган фаол моддани танлаш ва уни иммобиллизациялаш орқали амлга оширилади.
Тартибли меxанизмда лиганд А ни имобилазиция қилиш, аффин xромотаграфиясини оддий баъзи аффин чекланишларсиз амалга ошади. Бу холда лиганд В ни имобилизацияси, комплементар молекула учун конкурент (рақобатли) жараённи туғдирмайди. Майда баъзи бир ҳолатлар бундан мустаснодир, яъни колонкага киритишда ишчи буфер эритмасида лиганд А бўлмаслик ҳолатлари.. Шундай қилиб, лиганд А ни муҳитда бўлиши, сорбентда иммобилланган ферментларни боғлашда зарурдир. Чунки лиганд В лиганд А-фермент иккиламчи комплексни боғлайди. Бу ўз навбатида xромотографияга аввалдан саралаб-танловчан боғлашни ҳосил қилишни тақозо этади.
кейинги иллюгерлаш эса ишчи буфер эритмасидан лиганд А олиб ташлаш билан эришилади.
Кўпчилик пиридиннуклеотид тобе (ёки боғлиқ) дегидрогеназалар қуйидаги сxемага мувофиқ тартибли кинетик меxанизмга эгадир:



бу ерда E-дегидрогеназа, NAD⁺ ва NADН- никотинамидадениндинуклеотиднинг қайтарилган (оксидланган) ва тикланган холатлари, P-махсулот, S- субстрат протоколаг-пролингидроксимазанинг аффин xромотографиясидир . Ферментлар билан катализланадиган жуда кўп реакцияларга косубстратлар вазаифасини коферментлар бажаради. Бундай ферментлар камида иккита специфик боғловчи қисмга эга бўлиши шарт- бири кофермент учун бўлиб, у барча лигандлар учун умумий ҳисобланади. Ва яна бири ёки бир нечтаси субстрат учун. Бoғланишнинг сўнгги маркази, мувофиқ равишда , субстрат ва катализланаётган реакциянинг табиати билан белгиланиши керак. Шунинг учун иммобилланган коферментлар, икки ва кўп субстратли реакцияларни катализлайдиган ферментлар гурухини танлаб сорбцияланиши шарт.

Z-Gly- D- Pne- NH,- сефаронидаги тозаланмаган ланкреатик экстрат xромотографияси.

Икки субстратли ферментатив реакциялар 2та меxанизмга эгадирлар:
1-расмда икки субстратли мажбурий (тартибли) меxанизм кўрсатилган