Аффин хромотографияси

Гель – хроматография усули билан коньюгатларни тозалаш. Конъюгатларни тозалаш учун, гель-хроматография усули TSK HW-55 гелида ўтказилди. Бунда 4та фракция олинди. Олинган фракциялардан фақат 2-фракция ҳам серологик, ҳам ферментатив фаолликка эга эканлиги маълум бўлди. Эҳтимол, антитана - антитана комплекси 1-чи фракцияда мавжуд. Чунки, 1-фракция йирик молекулали бўлиб, массаси анча катта. Фермент – фермент комплекси ва фермент-антитана фракциялари эса 3-4 фракцияларга тегишлилиги аниқланди. Тозаланган коньюгатни серологик фаоллиги радикал иммунодиффузия услуби бўйича текширилди. Олинган маълумотлар коньюгатлар етарли серологик ва амилолитик фаолликка эга эканлигини кўрсатди. Коньюгатни умумий чиқими, тозалаш учун олган дастлабки аралашмани 33.48% фаоллигини ташкил қилди.
Юқоридагилар асосида шулар маълум бўлдики, бир босқичли усулда синтезланган коньюгатлар, қўшимча тозаланишни талаб қилади. Бироқ, тозалаш жараёнида улар ўзининг бирмунча фаоллигини йўқотади. Лекин шуни таъкидлаш лозимки, бир босқичли усулда синтезланган коньюгатлар тозалашдан кейин, ўз фаоллигини 1 йилгача сақлайди.
Қаттиқ ташувчи асосида коньюгат синтези (мўлжалли услуб). Ишлаб чиқилган ушбу ишнинг моҳияти шундаки, бунда коньюгат синтези қаттиқ ташувчида амалга оширилади. Антиген иммобилланиб, сўнгра антитаначалар қўшилади. АГ-АТ комплексининг пайдо бўлиши билан глутар диальдегид томонидан модификацияланган фермент киритилади. Бунда олинган коньюгат ўзига хослиги билан фарқ қилади ва қўшимча тозалашни талаб қилмайди. Шунинг учун қуйидаги услубни ишлаб чиқишда биз П-6 полиамид асосида иммуносорбент синтезладик. Бунда лиганд сифатида дифтерия токсини антигенини ишлатдик. Иммуносорбентни синтезлаш учун аввал полиамидни 2,05Н HClда 2 соат 45⁰С ҳароратда фаоллаштирдик. Буфер билан ювилгандан кейин, сорбент 2,5% глутар альдегиди билан 2 соат давомида модификация қилинди. Кейин эса, дифтерия токсинига антитаналарни қўшиб, 48 соат давомида инкубация қилдик. Бунда боғланган антигенларнинг сони 81мгни ташкил қилди. Ушбу усулда олинган иммуносорбент, ташувчи сифатида коньюгат синтезлашда фойдаланилди.
Кейинги босқичда антитаналар сорбцияси амалга оширилди. Баъзи факторлар, жумладан иммуносорбентдаги антитана сорбциясининг оптимал шароитлари ўрганилди. Аниқланишича, рН 8.0да 4⁰С ҳароратда 16 соат давомида, иммобилланган антигенларда антитаналарнинг максимал сорбцияси содир бўлади. Иммуносорбентда иммун комплекс олингандан сўнг, бу муҳитга фермент қўшилди. Бунинг учун α – амилазани 0,05% глутар альдегиди билан модификациялаб, сўнг ферментни иммуносорбентда 18 соат давомида, 4⁰С ҳароратда инкубация қилдик. Сорбентдан коньюгат десорбциясини трис – HCl буферда рН-2,3да амалга оширдик. Олинган коньюгатни 0,5М бикарбонат натрий ёрдамида тезгина нейтралладик. 0,05 М NaCl эритмасига қарши диализ қилдик, бунда коньюгатнинг чиқиши 35,6%ни ташкил қилди. Ўтказилган тадқиқотлардан шу нарса маълум бўлдики, олинган коньюгатлар ферментратив фаолликка эга бўлиб, улар ортиқча тозалашни талаб этмайди. Аммо синтезланган конъюгатлар фаоллиги жиҳатидан унчалик юқори эмаслиги маълум бўлди. Шу сабабли кейинги босқичда конъюгатларни йўналтирилган усулда синтезлашга киришдик.