Amaliy mashg’ulotlar materiallari amaliy mashg`ulot №1. Oqsil molekulasining aminikislota tarkibini aniqlash usullari

OKSILLARNI FRAKTSIYaLASH YULI BILAN AJRATISH.
Oksillarni ekstratsiya kilingandan sung ekstraktni tsentrifiguralash yordamida tukima elementlaridan tozalaniladi va eritmaga utgan oksillarni fraktsiyalash yuli bilan ajratiladi. Xozirgi paytda kuyidagi usullar bilan oksillar fraktsiyalarga ajratiladi: tuzlar ta’sirida chuktirish.
Issiklik ta’sirida denaturatsiyalash usuli organik erituvchilar yordamida chuktirish, xromatografiya, gelьfilьtratsiya, elektroforez, ulьtratsentrifugalash usullari bilan oksillar fraktsiyalari ajratiladi.
OKSILLARNI TUZLAR TA’SIRIDA CHUKTIRIB AJRATISH.
Oksillarni ishkoriy va ishkoriy yer metall tuzlari ta’sirida chuktirib fraktsiyalanganda ular uz xossalarini saklab koladi, chunki dializ yoki gelьfilьtratsiya usuli bilan oksil chukmasidan tuzlar ajratib olinsa oksil eritmaga utadi. Bu usul biologik aktivlikka ega bulgan fermentlarni ajratib olishda katta axamiyatga egadir.
Klinik laboratoriyalarda kon zardobiga globulin oksilarni ajratib olishda ammoniy sulьfatni yarim tuyingan eritmasi yordamida alьbumin oksillarni esa tula tuyingan eritma ta’sirida chuktirib ajratib olinadi. Tuzlar bilan oksilni chuktirishda oksilning tabiati tuzlarning kontsentratsiyasi xamda eritmani rN va temperaturada axamiyatga ega buladi.


DIALIZ USULI.
Yukori molekulali moddalar tarkibidagi kichik-kichik molekulali moddalarni yarim utkazgich membranalar yordamida ajratish usuliga dializ deyiladi.
Dializ usuli kolloid zarrachalarni yarim utkazgich membranalardan utmasligiga asoslangan. Yarim utkazgich membranalarga kallodiy, tselofan pergament kogozlari misol buladi.
Inson va xayvon organizmida buyrakdagi Boumen - SHumlyanskiy kapsulasining pardalari xam yarim utkazguvchandir. Dializ uchun ishlatiladigan asbobni dializator deyiladi. Oddiy dializator sifatida kollodiy va tselofan kopchasi ishlatiladi. CHuktirib ajratilgan oksil chukmasini kollodiy yoki tselofan xaltachasiga solinadi va xaltacha distillangan suv solingan idishga tushiriladi. Bunda vakt utishi bilan xaltacha ichidagi kichik molekulali moddalar (tuzlar) xaltacha tashkarisidagi distillangan suvga chikadi. Oksil esa yarim utkazuvchi parda teshikchalaridan utolmaydi va xaltacha ichida koladi. Oksillar aralashmasini ion almashuvchi adsorbtsiyalovchi xromatografiya, gelьtfilьtratsiyalash va afinn xromatografiya yordamida xam fraktsiyalarga ajratiladi.
A) ionalmashuv xromatografiyasi.
Bu usulda ikki xil ion almashtiruvchi adsorbentlar sifatida ishlatiladi.

1. 
   Kuchli va kuchsiz asosli anion almashtiruvchilar. Bularga polistrol va tsellyuza xosilalari kiradi.
   
2. 
   Kation almashtiruvchi polistirollarga sulьfat birikmalari va karboksilmetiltsellyuza kiradi.
   

Ion almashtiruvchi moddalar kollonkaga uzun shisha naycha solib kuchsiz kislota yoki asos bilan yuviladi. Sungra oksil eritmasi utkaziladi. Bunda oksil molekulasi anion yoki kation gruppalarga bulinishi natijasida oksillarni tuzlarning turli rN li eritmasi yordamida ajratib olinadi.
b) Adsorbtsion xromotografiya.
Bu usulda adsorbent sifatida aktivlangan kumir va alyumin oksidi ishlatiladi. Adsorbent kolonkaga solinib, erituvchi kuyiladi va oksil eritmasi solinadi, bunda oksil adsorbent bilan birikadi. Sungra oksil fraktsiyalari turli rN li bufer eritmalari yordamida ajratib olinadi.
Oksillarning fraktsiyalarga ajratishda taksimlanuvchi xromotografiya usulidan foydalaniladi. Taksimlanish xromatografiyasi adsorbtsion xromatografiyani turi bulib, adsorbent sifatida xromatografiya kogozi, kraxmal, silikagelь va boshkalar ishlatiladi.
v) Gelь xromatografiyasi.
Bu usulda xar xil gellar ishlatiladi, masalan: dekstrindan tayyorlangan, turli markadagi safadekslar, dekstron - yukori molekulali glyukoza koldiklaridan tarkib topgan polimer moddadir, uni ishkoriy muxitda epixlorgidrin bilan reaktsiyaga kiritilsa gel xosil buladi. Poliakrilamid gelini xosil kilish uchun suvda yaxshi eriydigan monomer akrilamid olib bu funktsional reagentlar ishtirokida polimerlashtiriladi.
Oksillarni molekulalari katta yoki kichikligiga karab gelxromatografiya kolonkasiga gel tuldirilib undan oksillar aralashmasi utkazilsa avvalo kichik molekulalik oksillar gel govaklari orkali, gel zarrachasining ichiga kirib diffuziyalanadi.
Yirik molekulali oksillar bu govakchadan utolmaydi, ular zarrachaning tashkarisida koladi va eritma bilan kolonkadan okib chikadi.
g) Afinn xromatografiya.
Bu xromotografiya usuli kuyidagi printsiplarga asoslangan buladi: ajratib olinishi lozim bulgan oksilga spetsifik bulgan modda Z-ligandda erimaydigan M moddasiga mustaxkam kilib biriktiriladi. SHunday kilib, tayyorlangan MZ-adsorbenti xromatografiya kolonkasiga solinadi va u orkali oksil aralashmasi utkaziladi. Bunda R oksili spetsifik adsorbent bilan birikadi. MZ+P=MZP. Sungra kolonka yaxshilab yuviladi va birikkan R-oksilining birikmasini dissotsiatsiya kiluvchi eritma bilan ajratib kolonkadan chikariladi.