Кафедра генетики, микробиологии и биотехнологии курсовая работа№1 формирование коллекций микроорганизмов

4.1 Консервирование высушиванием из жидкого состояния (L-высушивание)

Консервирование высушиванием из жидкого состояния – это разновидность простейшего метода непродолжительного метода хранения микроорганизмов – высушивания на твердых носителях (адсорбентах), таких как почва, бумага, стеклянных бусах и др. В процессе высушивания происходит обезвоживание клеток и замедление биохимических реакций.

Лучше всего переносят сушку спорообразующие виды бактерий. Адсорбенты защищают клетки от чрезмерного высыхания [Червякова, Валова, Осин, 2016]. L-высушивание отличается от обычного высушивания тем, что микроорганизмы в суспензионной среде высушивают под вакуумом в стеклянных ампулах, которые в свою очередь погружены в водяную баню с определенной температурой. Таким образом, это вакуумная сушка культур, находящихся в жидкой среде. В технологии сушки из жидкого состояния различают две стадии – первичное и вторичное высушивание. Таким способом можно хранить микроорганизмы, которые не переносят заморозку или лиофилизацию. Однако метод очень сложный в исполнении и включает в себя множество стадий: стадию по подготовке микробных клеток, стадию по подготовке стабилизатора-носителя, заполнения ампул, высушивание. Также необходимо дорогостоящее оборудование, способное воспроизводить ключевые параметры для щадящего обезвоживания бактериальных клеток [Похиленко, Баранов, Детушев,2009].

4.2 Лиофилизация микроорганизмов

Лиофилизация, является одним из самых экономичных и эффективных методов длительного хранения бактерий и других микроорганизмов. При его использовании многие физиологически разнородные виды бактерий и бактериофаги удается сохранять в активном состоянии 30 лет и более, что обеспечивает поддержание жизнеспособности коллекций. Этим методом бактерии можно хранить небольшими порциями в ампулах. Сама процедура лиофилизации достаточно проста, однако ее теоретические аспекты довольно сложны [Червякова,Валова,Осин, 2016].
Лиофилизация - широко распространенный способ высушивания биоматериалов из замороженного состояния, при котором вода испаряется в условиях вакуума без оттаивания льда, что позволяет полностью сохранять первичную структуру объекта сушки [Бланков,1961].
Успех лиофилизации зависит от качества используемых клеток, от того, насколько они жизнеспособны и в каких условиях выросли. Выращивают достаточно большое количество клеток так, чтобы в суспензии содержалось не менее 108 клеток/мл. Их собирают в период максимальной стабильности и жизнеспособности культуры, т.е. в поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазах роста.
Выживаемость лиофилизированных клеток зависит от специфических особенностей вида и штамма, стадии роста и концентрации клеток, состава защитных сред, режима лиофилизации, условий реактивации. После лиофилизации для выведения клеток из состояния анабиоза создают условия, снижающие осмотический шок и стресс, возникающий при вскрытии ампул. При лиофилизации вода из объектов удаляется без нарушения нативной структуры белка, формируется рыхлая структура. Она обладает свойствами высокой растворимости и регидратации. При увлажнении лиофилизированные бактерии восстанавливают свои первоначальные свойства, если добавить воды [Куплетская, Нетрусов 2011].
Процесс лиофилизации идет в несколько стадий:
1) Глубокая заморозка клеток в ампулах в специальной рабочей камере. Чем быстрее температура придет к необходимому значению, тем быстрее в процессе сушки пойдет испарение льда из исследуемого объекта.
2 )Первичное высушивание - испарение льда из замороженного раствора и его оседание на конденсоре. Для этого процесса по всей системе создается вакуум.
3)Вторичное высушивание - пары воды переносят за счет парциального давления на змеевик конденсора [Сидорчук, Краснова, 2016].
Этот метод оптимален для быстрорастворимых культур, поскольку содержит низкий продуцент воды в лиофилизированном препарате. Также достоинством лиофилизации является то, что она позволяет избежать разрушения и дегенерации культуры, наиболее оптимальна для штаммов с высокой термоустойчивостью и высокой окисляемостью. А равномерное распределение неорганических соединений внутри исследуемой культуры в ходе проведения метода позволяет избежать его затвердения. При использовании этого метода наблюдается легкость осуществления стерильных операций: оборудование для этого метода герметично, степень его стерильности высока, что уменьшает вероятность загрязнения исследуемой культуры. Кроме того недостаток кислорода способствует стерилизации что ведет к прекращению роста микробных контаминантов.
Лиофилизированную культуру хранят при температуре ниже 5 градусов. В ходе долгих лет исследований замечена интересная закономерность: с понижением температуры растет сохраняемость клеток. Поэтому при комнатной температуре хранить культуры не рекомендуется. При реактивации лиофилизированную культуру переводят в суспензию сразу после вскрытия ампул, добавляя в каждую стерильной жидкой среды. Суспензию в ампулах хорошо перемешивают и переносят в пробирки жидкой среды. После тщательного перемешивания отбирают суспензии и наносят на твердую полужидкую среду того же состава. Необходимо проверять чистоту культуры до лиофилизации и после нее. Для этого суспензию клеток стерильно разводят и делают посев штрихом на твердые среды. Пробирки и чашки со средой инкубируют при оптимальной температуре и, как только начинается их рост, делают пересев на свежую среду, чтобы убедиться в чистоте культуры. Рост бактерий, подвергшихся лиофилизации, часто начинается после длительной лаг-фазы. Поэтому нельзя делать заключительные выводы о гибели клеток, если инкубация не была достаточно длительной.