Кафедра генетики, микробиологии и биотехнологии курсовая работа№1 формирование коллекций микроорганизмов

4.3 Консервация замораживанием при низких температурах

В настоящее время криоконсервирование широко используют для хранения микроорганизмов – объектов биотехнологий, т.к. данный метод обеспечивает сохранение генетической стабильности и основных физиолого-биохимических свойств культур. Показано, что хранение при температуре жидкого азота обеспечивает высокую выживаемость (80–99%), сохранение основных морфофункциональных свойств и стабильного потенциала роста бактерий. Установлено, что оптимальным режимом замораживания для жидких культур является медленное охлаждение (4°С/мин), для концентрированных суспензий – быстрое охлаждение (400°С/мин). Выживаемость бактерий при низкотемпературной консервации в значительной степени определяется скоростью замораживания и отогрева [Савкина, Терновский, 2014]. Перед учеными стояла цель понять, как микроорганизмам удается выживать в условиях холода и повреждающего действия низких температур, а также выяснить причины устойчивости организмов к переохлаждению и замерзанию. В результате этих исследований и зародился метод замораживания.
Буквально замораживание микроорганизмов – это превращение воды в лед и замедление либо прекращение клеточного метаболизма. Говоря более конкретно криоконсервация – перевод клеток в состояние глубокого анабиоза с помощью заморозки с дальнейшим возвратом в исходное состояние. В этом методе есть значительное преимущество перед лиофилизацией, которое заключается в том, что штаммы, хранящиеся таким способом, могут использоваться сразу после реактивации без адаптационного периода бактериальных культур [Пушкарь, Белоус, 1975].Условия культивирования клеток, методика разбавления и питаний, а также состояние их в момент замораживания имеют немаловажное значение для выживаемости клеток в процессе замораживания. Например, клетки в ранней фазе роста более чувствительны к действию низких температур.
Существует два типа процессов, влияющих на выживаемость клеток в суспензии в процессе замораживания. Первый процесс приводит к необратимой денатурации растворенных белков, высаливанию цитоплазматической мембраны и повреждения ее в результате значительного уменьшения объема клетки. К этому приводит чрезмерное обезвоживание клеток, потому увеличивается концентрация в клетке осмотически активных веществ. Ко второму типу процессов относится повреждение внутриклеточного содержимого вследствие развития внутриклеточной кристаллизации.
Чтобы хранить микроорганизмы с помощью метода заморозки при низких температурах, необходимо подготовить клетки, просуспензировав их в среде, которая содержит криопротекторы. Затем пробы заливают в стерильные емкости, устойчивые к криодеструкции и запаиваю. Следующий шаг – это заморозка в заполненной жидким азотом емкости. Завершающий этап – оттаивание на водяной бане при 37 °С и слабом встряхивании. После того, как растает весь лед, ампулы дезинфицируют этанолом, вскрывают и в стерильных условиях переносят культуру на свежую среду [Белоус, Грищенко, 1994].
Практически все известные группы бактерий способны длительно храниться в замороженном состоянии при низких температурах. Так температурную область хранения обеспечивают сжиженные газы – воздух, азот, неон, водород, гелий. Исполняя роль холодильных агентов, они могут относительно долго оставаться в сосудах Дьюара или сделанных по их принципу специальных хранилищах с хорошей теплоизоляцией. Испаряясь под атмосферным давлением, эти газы в сжиженном состоянии достаточно хорошо поддерживают постоянную температуру нормального кипения каждого из них [Герна, 1983].
Существует довольно высокая индивидуальная чувствительность различных бактерий к действию низких температур, которые по разному реагируют на факторы. Микроорганизмы по их чувствительности делятся на 4 группы:
-Микроорганизмы, которые выживают практически во всех условиях замораживания и оттаивания
- Микроорганизмы, довольны устойчивые к непосредственному действию низких температур, но восприимчивые к условиям последующего хранения.
- Штаммы, чувствительные к непосредственному замораживанию и к отдаленным его последствиям
-Культуры, которые не переносят замораживания при различных условиях.
Из-за образования кристаллов, высоких концентраций внутриклеточных и внеклеточных растворов клетки подвергаются воздействию, помимо низких температур (от минус 20 до минус 196˚С), целого комплекса стрессовых физико-химических факторов. Сюда же можно отнести изменение pH среды, осмотические концентрационные градиенты и другое. Кроме того, при высоких скоростях охлаждения образуются внутриклеточные кристаллы льда, вызывающие повреждения и гибель клеток. При быстром охлаждении в мембранах образуются гидрофильные каналы, через которые происходит утечка из клеток веществ. При медленном охлаждении липидные цепочки перестраиваются и препятствуют образованию таких каналов. При понижении температуры с усилением роста кристаллов уменьшается просвет между ними и повышается концентрация раствора. Оптимальной скоростью считается та, при которой клетки подвергаются наименьшим повреждениям. Также повреждение клеток связано со степенью кристаллизации воды, от количества и формы кристаллов. Это связано с интенсивностью и степенью обезвоживания клетки. Для каждого типа клеток существует оптимальная скорость охлаждения, при которой клетка сохраняет свою структуру. Она настолько мала, что внутриклеточная кристаллизация не успевает развиться, однако, чтобы свести к минимуму период экспозиции клеток в солевом растворе, образующемся при вымораживании воды в виде чистого льда, ее хватает [Белоус, Грищенко, 1994]. Недостатком такого хранения микроорганизмов является необходимость специального оборудования, дороговизна, необходимы меры предосторожности при проверке герметичности стеклянных ампул для предупреждения взрыва.