Кимёда физикавий усуллар

1. Нуклеотидлар таркибидаги асосларни аниқлаш
Нуклеотидлар таркибига кирувчи асосларнинг ҳар бирининг УБ спектрида ўзига хос ютилиш максимумлари бор. ДНК таркибига кирган асосларни аниқлаш учун аввал гидролиз қилинади ва хроматография услуби ёрдамида бир-биридан ажратилади, кейин ҳар бир асос учун _макс ва  қиймат аниқланади. Булар аденин учун 260,5 нм; тимин-264,5 нм; гуанин-24б нм; цитозин-267 нм. Асосларни бир-биридан фарқлаш учун D₂₅₀D₂₈₀ нисбатни ўлчаш зарур. Бу нисбат қийматлари аденин учун 2,0: тиминга-1.26: гуанинга-1,63 ва цитозин учун 0,31 га тенг.
2. Эритмадаги нуклеин кислоталари ва оқсил
концентрациясини аниқлаш
Маълумки, оптик зичлик модданинг концентрациясига пропорционалдир, шунинг учун ҳам буларни ўлчаш орқали концентрацияни аниқлаш мумкин. Бунинг учун одатда маълум ютилиш максимуми қийматида амалий иш олиб борилади. Бу тўлқин узунлик қиймати оқсиллар учун 278-280 нм, нуклеин кислоталар учун эса 260 нм га тенг. Оқсилларда асосан ароматик хромофорлар соҳаси эътиборга олинади, аммо карбонил гурухи учун тегишли бўлган 190 нм соҳани ўлчаш учун мураккаб асбоб керак бўлади. Спектроскопик услубда концентрацияни аниқлаш жараёнида албатта ютилиш қиймати билан молекуланинг конформацияси орасидаги боғлиқликни эътиборга олиш зарур. Бу ишларни амалга ошириш учун албатта стандарт намуналар ва стандарт шароитлардан фойдаланилади.
3. УБ-спектри ёрдамида ДНК да бўладиган денатурация ва ренатурация жараёнларини ўрганиш
Агар ДНК ни маълум температура оралиғида қизди-рилса, D₂₆₀ қиймат ошиб боради. Бу жараён гиперхромия деб номланиб, денатурация учун мезон ҳисобланади, бунда ДНК жуфт спиралли тузилишдан тартибсиз йиғилган кўринишга айланади. Оддий оптик услуб ёрдамида ДНК га температуранинг, рН нинг, қўшилган кичик молекулали моддаларнинг, қутбсиз ва қутбли эритувчиларнинг таъсирини ўрганиш мумкин. Бу услуб ДНК нинг айрим муҳим хоссаларини ўрганишда аҳамияти катта ҳисобланади.
ДНК нинг ҳарорат таъсирига барқарорлиги гуанин-цитозин жуфти миқдорига боғлиқ, чунки бу икки асоснинг орасидаги водород боғларининг энергияси аденин-тимин жуфти ҳосил қилган водород боғ энергиясидан катта бўлади.

Гуанин	Цитозин
Аденин	Тимин

Температура ортиб бориб кейин унинг маълум бир нуқтасида оптик зичлик ўзгармасдан қолиши мумкин, ҳамда оптик зичлик аввалги қийматига тушиб қолади. Бу жараён занжирлар тўла бир-биридан ажратилмаса бошланғич тузилиши осонлик билан тикланиши мумкин. Занжирнинг бир-биридан тўла ажралиб кетиши учун маълум температурада ДНК нинг оптик зичлиги қийматини 260 нм тўлқин узунликда доимий бўлиб қолиш ҳолати рўй бериши керак (65-расм).

65-расм. ДНК оптик зичлик қиймати билан температура орасидаги боғланиш (pH7,8; 0,01 М фосфатли буфер эритма).

ДНК суюлиш эгри чизиғини аниқлаш натижасида мак-ромолекуланинг конформацион хоссалари ҳақида муҳим моълумот олиш мумкин. Замонавий спектрофотометрлар эритма жойлашадиган идишчалар билан жиҳозланган бўлиб, уларни осон термостатга жойлаштириш ва температурани 0° билан 100° оралиғида ушлаб туриш мумкин. Бу ишлар автоматик тарзда бажарилиб, бунда температура ва оптик зичлик қийматлари аниқланади. Суюлиш эгри чизиғни олиб ва D ни доимий бўладиган ҳолатидаги температурани аниқлаб ДНК даги гуанин-цитозин жуфтликлари миқдорини топиш мумкин, чунки суюқланиш темнератураси гуанин—цитозин жуфтлик миқдорига чизиқли боғлиқ ҳисобланади.

Полипептид ва оқсил конформацияларни ўрганишга юқоридаги усул ўрнига бошқа услублар ишлатиш мақсадга мувофиқ ҳисобланади.
Шундай қилиб, оптик спектроскопиянинг турларидан бўлган УБ услуб нуклеин кислоталарнинг тузилиши ва ҳолатларини ўрганишда керакли маълумотлар беради. Ютилишнинг ҳосил бўлишига асосий сабаб, нуклеин кислоталарнинг таркибидаги пурин ва пиримидин асосларининг борлигидир. Айрим асосларнинг УБ соҳасидаги ўзига тегишли максимум қийматлари бўлгани учун бу услуб ёрдамида нуклеин кислота таркибидаги асосларнинг миқдорини билиш мумкин, аммо буларнинг бирламчи структураси ва асосларнинг занжирида жойлашиш кетма—кетлигини аниқлашда УБ-спектроскопиянинг берган маълумотлари етарли эмас.
Полинуклеотид занжирида асослар кетма—кетлигини ўзгаришига сезгир оптик услублардан бири биополимерларнинг оптик активлигига асосланган оптик бурилиш дисперсияси ва айланма дихроизм ҳисобланади.