Клинико-лабораторные аспекты поражения почек у больных артериальной гипертензией, перенесших

6. Определение концентрации цитокинов методом иммуноферментного анализа. Для оценки активности иммуновоспалительного процесса проводилось определение концентрации про– и противовоспалительных цитокинов: ИЛ–1β, ИЛ–6, ФНО–α, ИЛ–8 и ИЛ–10 в сыворотке крови. Для получения сыворотки использовали использовалась периферическая кровь, взятая натощак из локтевой вены в стерильных условиях в количестве 5 мл. Образцы крови центрифугировались со скоростью 3500–4000 об/мин в течение 10 минут, затем сыворотку аликвотировали и замораживали при температуре ниже –20 °С и хранили от 1 до 4 месяцев без повторных циклов размораживания и оттаивания.
Непосредственно перед анализом все исследуемые сыворотки и компоненты тест– системы прогревались при комнатной температуре. Иммуноферментный анализ (ИФА) выполнялся с помощью наборов реактивов ООО «Цитокин» (Санкт– Петербург) строго по протоколу исследования, предложенному фирмой– производителем. В состав набора реактивов входит комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов с рамкой с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок моноклональными антителами к цитокинам, конъюгаты поликлональных антител и калибровочные образцы.
Принцип анализа заключался в «сэндвич» – варианте твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к цитокинам. Одно из антител иммобилизовано на твердой фазе (внутренней поверхность лунок), второе конъюгировано с биотином. На первой стадии анализа определяемый цитокин, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах, связывается с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. На второй стадии анализа иммобилизованный антиген взаимодействовал со вторыми антителами, меченными биотином. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству цитокина в исследуемом образце.
На последней стадии в лунки вносился конъюгат стрептавидин–пероксидаза. Затем по окончанию инкубации лунки промывались четырёхкратно и вносился необходимый объём, окрашивающий раствора тетраметилбензидина. Во время инкубации стрипов в течение15 – 20 минут происходило окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся меченых антител.
После инкубации с окрашивающим раствором во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и в субстратную смесь, добавлялась 10% кислота, маркированная «Стоп–реагент» для остановки ферментной реакции, и проводилось встряхивание на шейкере 5 мин.
Следующим этапом проводилось измерение оптической плотности в лунках при длине волны 450 нм с помощью мультимодального микропланшетного ридера CLARIOstar ® BMG LABTECH, обеспечивающим высочайшую чувствительность и сверхбыстрым спектрометром. Учет реакции, построение калибровочных графиков и определение концентрации цитокинов проводился на ридере, который работает в диапазоне320–850 нм.
Изначально рассчитывалась концентрация для каждой калибровочной или исследуемой пробы величину В–В0, где В – среднее значение оптической плотности в лунках, содержащих калибровочные или исследуемые пробы, В0 – среднее значение оптической плотности в лунках, содержащих калибровочную пробу «0 пг/мл». После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывалась концентрация исследуемого цитокина в определяемых образцах. Все этапы реакции проходили в термостатируемых условиях и на шейкерах Orbital Shaker PSU–10i (Biosan).
Коэффициент вариации результатов 10–ти определений ИЛ–1β , ФНО–α, ИЛ–8 и ИЛ–10 в одном и том же образце с использованием набора не превышал 10%. Минимальная достоверно определяемая набором концентрация IL–1b в исследуемых образцах не превышает 4 п1 й группы/мл, для ИЛ–6, ИЛ–10 не превышает 5 пг\мл, для ФНО–α не превышает 1 пг/мл, для ИЛ–8 – 9,75г/мл.