Kurs ishining maqsadi : genomni tahrirlashning asosiy usullarini o'rganishdir. Ushbu maqsad bilan bog'liq holda biz quyidagi vazifalarni
Boshqariladigan genomni tahrirlash
Download 129.43 Kb. Pdf ko'rish
|
Gen
|
2.3.
Boshqariladigan genomni tahrirlash CRISPR-Cas9 tizimining keyingi takomillashuvlari va variantlari undan foydalanishda ko'proq nazoratni joriy etishga qaratilgan. Xususan, ushbu tizimni takomillashtirishga qaratilgan tadqiqotlar uning o'ziga xosligini, samaradorligini va tahrirlash qobiliyatining nozikligini oshirishni o'z ichiga oladi. Texnikalarni qo'shimcha ravishda ular o'zgartiradigan tizim komponentiga qarab ajratish va tasniflash mumkin. Bularga Cas oqsilining boshqa variantlari yoki yangi yaratilishlaridan foydalanish, umuman boshqa effektor oqsilidan foydalanish, sgRNKni o'zgartirish yoki mavjud optimal echimlarni aniqlash uchun algoritmik yondashuvdan foydalanish kiradi. O'ziga xoslik CRISPR-Cas9 tizimini takomillashtirishning muhim jihati hisoblanadi, chunki u yaratadigan maqsaddan tashqari ta'sir hujayra genomi uchun jiddiy oqibatlarga olib keladi va undan foydalanishda ehtiyot bo'lishni talab qiladi. Maqsaddan tashqari ta'sirlarni minimallashtirish tizimning xavfsizligini maksimal darajada oshiradi. O'ziga xoslikni oshiradigan Cas9 oqsillarining yangi o'zgarishlari avvalgi maqsadsiz ketma-ketliklarni nishonga olishga qodir bo'lgan original SpCas9 bilan solishtirish mumkin bo'lgan samaradorlik va o'ziga xoslikka ega effektor oqsillarni va maqsaddan tashqari mutatsiyalarga ega bo'lmagan variantni o'z ichiga oladi. Shuningdek, yangi Cas9 oqsillarini yaratish boʻyicha tadqiqotlar olib borildi, jumladan, baʼzilari crRNKdagi RNK nukleotidlarini DNK bilan qisman almashtiradi va strukturaga asoslangan Cas9 mutantlarini yaratish protsedurasi, ularning barchasi maqsaddan tashqari taʼsirlarni kamaytiradi. maqsaddan tashqari ta'sirlarni ham kamaytirish. Hisoblash usullari, shu jumladan mashinani o'rganish, berilgan maqsadlar uchun o'ziga xoslikni oshirish uchun tizimning yaqinligini bashorat qilish va noyob ketma-ketliklarni yaratish uchun ishlatilgan. CRISPR-Cas9 ning bir nechta variantlari yorug‘lik yoki kichik molekulalar kabi tashqi trigger yordamida genni faollashtirish yoki genomni tahrirlash imkonini beradi. Bularga yorug‘likka sezgir oqsil hamkorlarini faollashtiruvchi domen va gen faollashuvi uchun dCas9 bilan birlashtirish yoki sintez qilish orqali ishlab 20 chiqilgan fotoaktiv CRISPR tizimlari kiradi. Split-Cas9 ning ikkita konstruktsiyasi bo'lgan shunga o'xshash yorug'likka sezgir domenlar yoki Cas9 tarkibiga qafasli tabiiy bo'lmagan aminokislotalarni kiritish yoki genomni tahrirlash uchun foto bo'linadigan qo'shimchalar bilan hidoyat RNKni o'zgartirish orqali. Kichkina molekulalar yordamida genomni tahrirlashni nazorat qilish usullariga allosterik Cas9 kiradi, fon tahriri aniqlanmaydi, u 4-gidroksitamoksifen (4-HT), 4- HT-ga javob beradigan Cas9 yoki Cas9 qo'shilishi bilan bog'lanish va parchalanishni faollashtiradi. Bu to'rtta ERT2 domeniga birlashtirilganda 4-HT javob beradi. Intein-inducible split-Cas9 Cas9 fragmentlarini dimerizatsiya qilish imkonini beradi va split-Cas9 ning ikkita konstruktsiyasini FRB va FKBP fragmentlari bilan birlashtirish orqali ishlab chiqilgan rapamisin-induktsiyali split- Cas9 tizimi. Boshqa tadqiqotlar Cas9 ning kichik molekula, doksiklin bilan transkripsiyasini qo'zg'atishi mumkin edi. .Kichik molekulalar, shuningdek, gomologik yo'naltirilgan tuzatishni yaxshilash uchun ham ishlatilishi mumkin, ko'pincha gomologik bo'lmagan uchi qo'shilish yo'lini inhibe qilish orqali. VE-822 va AZD-7762 kichik molekulalari tomonidan induktsiya qilingan Cpf1 effektor oqsiliga ega tizim yaratildi. Ushbu tizimlar aniqlik, samaradorlik va fazoviy vaqt nazoratini yaxshilash uchun CRISPR faoliyatini shartli boshqarish imkonini beradi. Fazoviy vaqt nazorati maqsaddan tashqari ta'sirlarni yo'q qilish shaklidir - faqat ma'lum hujayralar yoki organizmning qismlarini o'zgartirish kerak bo'lishi mumkin va shuning uchun yorug'lik yoki kichik molekulalar buni amalga oshirish usuli sifatida ishlatilishi mumkin. CRISPR-Cas9 tizimining samaradorligi oqsillar va zarur reagentlarni yaratish uchun DNK ko'rsatmalarini to'g'ri etkazib berish orqali ham sezilarli darajada oshadi. CRISPR, shuningdek, maqsadli ketma- ketlikda bir yoki ikkita bazada maxsus tahrirlarni yaratish uchun bitta tayanch-juft tahrirlovchi oqsillardan foydalanadi. CRISPR/Cas9 o'ziga xos fermentlar bilan birlashtirilgan bo'lib, dastlab faqat C ni T ga va G ni A ga va ularning teskarisiga o'zgartira oladi. Bu oxir-oqibat hech qanday DNK parchalanishini talab qilmasdan 21 amalga oshirildi. Boshqa fermentning sintezi bilan CRISPR-Cas9 bazasini tahrirlash tizimi C dan G ga va uning teskarisini ham tahrirlashi mumkin. Klasterli muntazam intervalgacha qisqa palindrom takrorlash (CRISPR)/Cas9 tizimi genni tahrirlash texnologiyasi bo'lib, u har qanday joyda qo'sh zanjirli uzilishlarni (DSB) keltirib chiqarishi mumkin bo'lgan hidoyat ribonuklein kislotalari (gRNK) protospacer qo'shni motiv (PAM) ketma-ketligi bilan bog'lanishi mumkin.[105 ] Yagona zanjirli niklarni Cas9 nikkazalari deb ham ataladigan faol sayt mutantlari ham qo'zg'atishi mumkin. Oddiygina gRNK ketma- ketligini o'zgartirish orqali Cas9-endonukleaza qiziqish geniga yetkazilishi va DSB ni keltirib chiqarishi mumkin. Cas9-endonukleazning samaradorligi va genlarni maqsadli yo'naltirishning qulayligi sichqoncha va inson hujayralari uchun CRISPR-nokaut (KO) kutubxonalarining rivojlanishiga olib keldi, ular qiziqishning o'ziga xos gen to'plamlarini yoki butun genomni qamrab olishi mumkin. CRISPR skriningi olimga tirik model organizmlar ichida tizimli va yuqori o'tkazuvchan genetik buzilishni yaratishga yordam beradi. Ushbu genetik buzilish gen funktsiyasi va epigenetik tartibga solishni to'liq tushunish uchun zarurdir. Birlashtirilgan CRISPR kutubxonalarining afzalligi shundaki, bir vaqtning o'zida ko'proq genlarni yo'naltirish mumkin. Nokaut kutubxonalari barcha ifodalangan gRNKlar boʻylab teng koʻrinish va unumdorlikka erishish uchun yaratilgan va transduktsiya qilingan hujayralarni qayta tiklash uchun ishlatilishi mumkin boʻlgan antibiotik yoki lyuminestsent tanlash belgisini olib yuradi. CRISPR/Cas9 kutubxonalarida ikkita plazmid tizimi mavjud. Birinchidan, barchasi bitta plazmidda bo'lib, u erda sgRNK va Cas9 bir vaqtning o'zida transfektsion hujayrada ishlab chiqariladi. Ikkinchidan, ikki vektorli tizim: sgRNK va Cas9 plazmidlari alohida-alohida yetkazib beriladi. Infektsiyaning past ko'pligida (MOI, odatda 0,1-0,6 da) virusli transduktsiya yo'li bilan hujayralarning bir idishiga minglab noyob sgRNK o'z ichiga olgan vektorlarni etkazib berish muhimdir. ), bu alohida hujayra klonining bir nechta 22 sgRNK turini olish ehtimolini oldini oladi, aks holda bu genotipning fenotipga noto'g'ri tayinlanishiga olib kelishi mumkin. Birlashtirilgan kutubxona tayyorlangandan so'ng, sgRNKlarning ko'pligini aniqlash uchun PCR bilan kuchaytirilgan plazmid DNKning chuqur ketma- ketligini (NGS, keyingi avlod sekvensiyasi) amalga oshirish kerak. Qiziqarli hujayralar kutubxona tomonidan zararlangan bo'lishi mumkin va keyin fenotipga ko'ra tanlanishi mumkin. Tanlovning 2 turi mavjud: salbiy va ijobiy. Salbiy tanlov natijasida o'lik yoki sekin o'sadigan hujayralar samarali tarzda aniqlanadi. U omon qolish uchun zarur bo'lgan genlarni aniqlashi mumkin, ular keyinchalik molekulyar maqsadli dorilarga nomzod bo'lib xizmat qilishi mumkin. Boshqa tomondan, musbat tanlanish tasodifiy mutagenez orqali o'sish afzalligi olingan populyatsiyalar to'plamini beradi.[105] Tanlovdan so'ng genomik DNK yig'iladi va NGS tomonidan ketma-ketlashtiriladi. SgRNKning kamayishi yoki boyitishi aniqlanadi va sgRNA mos keladigan maqsadli gen bilan izohlangan asl sgRNK kutubxonasi bilan taqqoslanadi. Statistik tahlil keyinchalik qiziqish fenotipiga sezilarli darajada mos keladigan genlarni aniqlaydi Nokautdan tashqari, nok-down (CRISPRi) va faollashtirish (CRISPRa) kutubxonalari ham mavjud bo'lib, ular proteolitik tarzda o'chirilgan Cas9- termoyadroviy oqsillarning (dCas9) maqsadli DNKni bog'lash qobiliyatidan foydalanadi, ya'ni qiziqish gen kesilmaydi, lekin. haddan tashqari ifodalangan yoki bostirilgan. Bu CRISPR/Cas9 tizimini genlarni tahrirlashda yanada qiziqarli qildi. Faol bo'lmagan dCas9 oqsili dCas9-repressorlari yoki aktivatorlarini maqsadli genlarning promotor yoki transkripsiyali boshlang'ich joylariga yo'naltirish orqali gen ekspressiyasini modulyatsiya qiladi. Genlarni bostirish uchun Cas9 gRNK bilan kompleks hosil qiluvchi KRAB effektor domeniga birlashtirilishi mumkin, CRISPRa esa turli transkripsiya faollashtirish domenlari bilan birlashtirilgan dCas9 dan foydalanadi, bu esa gRNK tomonidan ekspressiyani tartibga solish uchun promotor hududlarga yo'naltiriladi. 23 XULOSA Genomni tahrirlashning asosiy usullarini o'rganib chiqib, quyidagi xulosalar chiqarishimiz mumkin. Induktsiyalangan mutagenez va induktsiyalangan poliploidizatsiya juda uzoq vaqtdan beri ma'lum, ammo ular hali ham talabga ega. Genomik tahrirlashning asosiy usullaridan hozirda ARCUT qaychi amalda qo'llanilmaydi, kimerik oligonukleotidlar, meganukleazlar, ZF va TALEN texnologiyalari kamdan-kam qo'llaniladi, chunki ular CRISPR / Cas texnologiyasidan "o'tib ketgan", ularning asosiy afzalliklari nisbiydir. tayyorgarlik jarayonlarining soddaligi va tezligi Shu bilan birga, genomga kiritilgan o'zgarishlarning aniqligi ushbu texnologiyaning turli xil takomillashuvlari tufayli ancha yuqori. Biroq, Garvard olimlari DNKni tahrirlashning yangi usulini taklif qilishdi - "asosiy tahrirlash usuli". Uni turli turdagi inson hujayralarida sinab ko'rgan tadqiqotchilarning fikriga ko'ra, bu usul CRISPR/Cas9 ga qaraganda aniqroq ishlaydi. |
