Mavzu: Koilin – rnk bog’lovchi funksiyalarga EGA multidomen oqsil. Reja: I kirish II asosiy qism

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Неотложная помощь в акушерстве и гинекологии – Persianinov 1989 y
. 

---

13 
1.2. Multi
domenli RNK-bog'lovchi protein IMP3 tomonidan klasterli 
RNK elementlarini kombinatsion tanib olish 
Ko'p domenli RNKni bog'laydigan oqsillar o'zlarining kombinator kodiga 
asoslangan maqsadli ketma-ketliklarini qanday tan olishlari hal qilinmagan asosiy 
savol bo'lib, hozirgacha tizimli ravishda o'rganilmagan. Bu erda biz ko'p domenli 
RNK-bog'lovchi prototipli oqsilga e'tibor qaratamiz, IMP3 (shuningdek, IGF2BP3 
deb ataladi), u oltita RNK-bog'lovchi domenni (RBD) o'z ichiga oladi: to'rtta KH va 
ikkita RRM domenlari. Biz bir domenda hal qilingan SELEX-seq, motiflar oralig'i 
tahlillari, in vivo iCLIP, funktsional tekshirish tahlillari va strukturaviy biologiyani 
birlashtirgan integrativ tizimli strategiyani yaratamiz. Ushbu yondashuv IMP3 ning 
RNK-bog'lash o'ziga xosligini va RNP topologiyasini aniqlaydi, unda barcha oltita 
RBD va beshtagacha aniq va mos ravishda joylashgan CA-ga boy va GGC-yadro 
RNK elementlaridan iborat klaster mavjud bo'lib, >100 nukleotid uzunlikdagi 
maqsadli RNK hududini qamrab oladi. Bizning umumiy qo'llaniladigan 
yondashuvimiz 
IMP3-RNKni 
tanib 
olishning 
o'ziga 
xosligini 
va 
moslashuvchanligini tushuntiradi, IMP3 maqsadlarini bashorat qilishga imkon 
beradi va genlarni tartibga solishda ko'p domenli RNKni bog'laydigan oqsillar bilan 
ko'p valentli o'zaro ta'sirlar funktsiyasi uchun paradigmani taqdim etadi. 
Insulinga o'xshash o'sish omili 2 mRNK-bog'lovchi protein 3 (IMP3 yoki 
IGF2BP3) mRNAs1 ning transkripsiyadan keyingi gen regulyatsiyasida ishtirok 
etadigan uchta yuqori darajada saqlanib qolgan RNK-bog'lovchi oqsillar (IMP1, 
IMP2 va IMP3) oilasiga tegishli. Sutemizuvchilarning uchta paralogi, asosan, 
embriogenez davrida namoyon bo'lishi va ekspressiya buzilgan taqdirda og'ir 
fenotiplar tufayli ko'pincha onkofetal sifatida tavsiflanadi2,3. 
RNK taqdirini modulyatsiya qilishning hozirda eng yaxshi tushunilgan IMP 
vositachiligi mexanizmi mRNP granulalaridagi maxsus transkriptlarning xavfsiz 
joylashuvini o'z ichiga oladi4. mRNKlarning bu qafaslari o'zining funktsional 
spektrida sitoplazmatik tashish5, barqaror mRNPs6,7,8 ichida kechikkan tarjima, 
sitoplazmatik saqlash va miRNK tomonidan boshqariladigan mRNKni erta tartibga 
solishdan himoya qilishdan iborat bo'ladi3,9,10,11,12. Bir nechta maqsadli 

---

14 
RNKlar taklif qilingan3,13, IMP1 ACTB mRNA zipcode elementi bilan 
bog'langan va barcha uchta IMP 3′-UTR orqali HMGA2 barqarorligini tartibga 
soluvchi hozirda eng yaxshi o'rganilgan misollar9,10,11,12,14,15,16 . 
IMP1 va IMP2 dan farqli o'laroq, IMP3 ning biologik ahamiyati uzoq vaqt 
davomida etarlicha baholanmagan. IMP3 bo'yicha tadqiqotlar asosan uning saraton 
bilan bog'liq ko'plab o'sma ob'ektlari bilan bog'lanishiga qaratilgan, chunki uning 
qayta ifodalanishi bemorlar uchun yomon prognoz bilan bog'liq bo'lib, IMP3 ni 
o'simta belgisi sifatida tasniflaydi17,18,19. 
IMP oqsillari oilasi ko'p domenli RBPlarning prototipik namunasini ifodalaydi 
va oltita potentsial RNKni bog'lash birliklarining umumiy arxitekturasi bilan 
tavsiflanadi: ikkita N-terminal RNKni aniqlash motivlari (RRMs) va to'rtta ketma-
ket hnRNP K-homologiyasi (KH) domenlari1. RNK-maqsadni aniqlashda bir nechta 
RBD qanday hamkorlik qiladi, bu uzoq vaqtdan beri davom etayotgan savol edi: 
alohida domenlarning qaysi biri ishtirok etadi, ularning hissasi qanday va RNK-oqsil 
o'zaro ta'siri qanchalik moslashuvchan? 
Ko'p qismli RNK motivlari bilan bog'lanishda bir nechta RBDlarning hissasi 
va kooperativligini baholash qiyin va umuman qo'llaniladigan yondashuv hozircha 
tasvirlanmagan. Bir nechta RBDlarning potentsial dinamik domen tartiblari tufayli, 
tizimli 
tadqiqotlar 
yechim 
texnikasi 
va 
kristallografiyani 
birlashtirgan 
integratsiyalashgan yondashuvni talab qiladi20,21,22,23,24. IMPlar uchun 
strukturaviy ma'lumotlar faqat IMP2 (RRM1, PDB-ID: 2CQH) va IMP3 (RRM2, 
PDB-ID: 2E44, ikkalasi ham nashr etilmagan) ning yagona RRMlari uchun mavjud. 
Juda qisqa bog'lovchi ketma-ketlikning mavjudligi ikkita domen ixcham tandemda 
joylashganligini ko'rsatadi, bu ularning RNK o'ziga xosligini ta'minlaydi. Shunga 
o'xshab, KH1-2 va KH3-4 tandem domenlari ikki tomonlama RNK ketma-ketlik 
motivlarini tanib olish uchun oldindan tuzilgan RNK-bog'lash modullarini 
ifodalovchi dalillar mavjud. Inson IMP1 KH3–414 tuzilmalari, shuningdek, tovuq 
orfologi ZBP116 ning KH3–4 di-domenlari KH3 va 4 oʻrtasida kengaytirilgan 
domen interfeysi mavjudligini isbotladi. Bu tuzilmalar maqsadli RNK motiflarini 
minimal oraliqda boʻlishini tavsiya qiladi. tandem RBDlar tomonidan tan olingan. 

---

15 
Masalan, ZBP1/IMP1 ning KH3–4 ikkita ketma-ketlik elementlari kombinatsiyasini 
taniydi: CGGAC-N10–25-(C/A–CA–C/U) ikkala mumkin boʻlgan tartibga 
solish14,15,16. 
Oldingi tadqiqotlar in vivo CLIP3,13,25 va in vitro tanlovlari (SELEX, 
RNAcompete va Bind-N-seq) 5,26,27,28 ga asoslangan IMPlarni qisqacha tanib 
olish ketma-ketligini taklif qildi, bularning barchasi CA ga boy umumiy konsensusni 
taklif qildi. . Biroq, in vitro tanlash yondashuvlarining asosiy cheklovi shundaki, ular 
odatda faqat bitta RNK-bog'lovchi motivni sig'dira oladigan qisqa degenerativ 
ketma-ketliklardan boshlanadi. Shu sababli, alohida domenlarning hissasi qiyin 
bo'lib qoldi. Va nihoyat, oldingi tadqiqotlar KH domenlarining RNK o'zaro ta'sirida 
muhim rol o'ynashini isbotlagan bo'lsa-da, ikkita RRM 5,14,15,16,29,30 ga hali hech 
qanday funktsiya belgilanmagan. 
IMP3-ni ko'p domenli RBPning prototip namunasi sifatida o'rganish uchun biz 
RNK-seq va kombinatoryal bioinform bilan birlashtirilgan tizimli, domenda 
echilgan SELEX protsedurasini o'rnatdik. atik yondashuvlar. Muhimi, biz SELEX 
uchun asos sifatida juda uzoq degeneratsiya ketma-ketligini (N40) ishlatdik, bu 
bittadan ortiq RNK-bog'lovchi domenga ega bo'lgan bir nechta RNK kontaktlariga 
ruxsat berish va tegishli bioinformatik intervallarni tahlil qilish. Bu bizni IMP3 
o'zining barcha tandem RNK-bog'lovchi domenlarining faolligi orqali - umumiy 
GGC yadrosi bo'lgan CA ga boy motivlar va ketma-ketliklardan tashkil topgan bir 
nechta cis-ta'sir qiluvchi RNK elementlarining kengaytirilgan qatorini tan olishini 
kashf qilishga olib keldi. Ushbu biokimyoviy topilmalar IMP3 KH va RRM-tandem 
domenlarining strukturaviy tahlili va RNK-bog'lanish tadqiqotlari uchun 
kristallografiya va NMRni birlashtirgan integratsiyalashgan strukturaviy biologiya 
tomonidan qo'llab-quvvatlanadi. 
Birgalikda biz RNK elementlarining tartiblangan qatorini IMP3 tomonidan 
tanib olish uchun biokimyoviy, bioinformatik va tizimli dalillarni taqdim etamiz, 
ular ma'lum bir oraliq naqshida joylashtirilgan va 100 nts dan ortiq bo'lishi mumkin 
bo'lgan hududlarni qamrab oladi. Ushbu model endogen IMP3 maqsadli 
mRNKlarini, shu jumladan yaxshi o'rganilgan HMGA2 transkriptini tahlil qilish 

---

16 
bilan qo'llab-quvvatlanadi, buning uchun biz IMP3 va let-7 miRNK o'rtasidagi 
funktsional o'zaro tartibga solishni o'rgandik. Xulosa qilib aytganda, biz yirik 
tartibga soluvchi mRNP komplekslarini tekshirish uchun asosni taqdim etamiz. 
Shunday qilib, biz har qanday ko'p domenli RNK-bog'lovchi oqsilga qo'llanilishi 
mumkin bo'lgan murakkab va kombinatoryal RNP tarmoqlarini tizimli ravishda 
ajratish uchun umumiy yondashuvni o'rnatamiz. 
IMP3 bir qator ketma-ketlik elementlarini taniydi 
IMP3 ning murakkab RNK-bog'lash xususiyatlarini sindirish uchun biz 
individual, GST yorlig'i ostidagi subdomenlardan foydalandik va in vitro SELEX 
protsedurasini qo'lladik, shu jumladan tasodifiy N40-RNK hovuzi va keyingi RNK-
seq tahlili bilan to'rtta tur tanlovi (1a-rasm, b va qo'shimcha 1-rasm). E'tibor bering, 
standart qisqa degeneratsiya hududlari o'rniga biz bir nechta motiflarning 
massivlarini, jumladan, ularning oralig'ini ajratish va tahlil qilish imkoniyatiga ega 
bo'lish uchun N40-RNK hovuzidan foydalanganmiz; bundan tashqari, biz 
tanlovning har bir bosqichidan keyin ketma-ketlikni amalga oshirdik, bu SELEX 
protsedurasi davomida ketma-ketlikni boyitish imkonini berdi.
1-rasm 

---

17 
atik yondashuvlar. Muhimi, biz SELEX uchun asos sifatida juda uzoq degeneratsiya 
ketma-ketligini (N40) ishlatdik, bu bittadan ortiq RNK-bog'lovchi domenga ega 
bo'lgan bir nechta RNK kontaktlariga ruxsat berish va tegishli bioinformatik 
intervallarni tahlil qilish. Bu bizni IMP3 o'zining barcha tandem RNK-bog'lovchi 
domenlarining faolligi orqali - umumiy GGC yadrosi bo'lgan CA ga boy motivlar 
va ketma-ketliklardan tashkil topgan bir nechta cis-ta'sir qiluvchi RNK 
elementlarining kengaytirilgan qatorini tan olishini kashf qilishga olib keldi. Ushbu 
biokimyoviy topilmalar IMP3 KH va RRM-tandem domenlarining strukturaviy 
tahlili va RNK-bog'lanish tadqiqotlari uchun kristallografiya va NMRni 
birlashtirgan integratsiyalashgan strukturaviy biologiya tomonidan qo'llab-
quvvatlanadi. 
Birgalikda biz RNK elementlarining tartiblangan qatorini IMP3 tomonidan 
tanib olish uchun biokimyoviy, bioinformatik va tizimli dalillarni taqdim etamiz, 
ular ma'lum bir oraliq naqshida joylashtirilgan va 100 nts dan ortiq bo'lishi mumkin 
bo'lgan hududlarni qamrab oladi. Ushbu model endogen IMP3 maqsadli 
mRNKlarini, shu jumladan yaxshi o'rganilgan HMGA2 transkriptini tahlil qilish 
bilan qo'llab-quvvatlanadi, buning uchun biz IMP3 va let-7 miRNK o'rtasidagi 
funktsional o'zaro tartibga solishni o'rgandik. Xulosa qilib aytganda, biz yirik 
tartibga soluvchi mRNP komplekslarini tekshirish uchun asosni taqdim etamiz. 
Shunday qilib, biz har qanday ko'p domenli RNK-bog'lovchi oqsilga qo'llanilishi 
mumkin bo'lgan murakkab va kombinatoryal RNP tarmoqlarini tizimli ravishda 
ajratish uchun umumiy yondashuvni o'rnatamiz. 
IMP3 ning murakkab RNK-bog'lash xususiyatlarini sindirish uchun biz 
individual, GST yorlig'i ostidagi subdomenlardan foydalandik va in vitro SELEX 
protsedurasini qo'lladik, shu jumladan tasodifiy N40-RNK hovuzi va keyingi RNK-
seq tahlili bilan to'rtta tur tanlovi (1a-rasm, b va qo'shimcha 1-rasm). E'tibor bering, 
standart qisqa degeneratsiya hududlari o'rniga biz bir nechta motiflarning 
massivlarini, jumladan, ularning oralig'ini ajratish va tahlil qilish imkoniyatiga ega 
bo'lish uchun N40-RNK hovuzidan foydalanganmiz; bundan tashqari, biz 
tanlovning har bir bosqichidan keyin ketma-ketlikni amalga oshirdik, bu SELEX 

---

18 
protsedurasi davomida ketma-ketlikni boyitish imkonini berdi. Single domains, such 
as RRM1 or KH1, did not show RNA-binding activity. In addition, previous 
structural studies had shown that at least the KH domains 3–4 of the related 
ZBP1/IMP1 are organized as a functional pseudo dimer (see the Introduction 
section). Therefore, we relied on truncated tandem domains for our analyses: 
RRM1–2, KH1–2, KH3–4, as well as an extended version containing all four KH 
domains, KH1–4 (Fig. 1a and Supplementary Fig. 1). In parallel, full-length IMP3 
(as positive control) and GST alone (as negative control and for background 
correction) were analyzed. Motif-enrichment analysis by z-score calculation was 
performed for all possible 4-, 5-, and 6-mers, and were corrected at each round with 
the corresponding GST SELEX round (top-10 enriched 6-mer motifs in Fig. 1c; 
complete dataset in Supplementary Data 1). In parallel, the correlation of motif-
enrichment datasets was tested for each tandem domain by comparison with the 
positive control, full-length IMP3 (Fig. 1d). 
For the full-length IMP3 protein, this SELEX analysis revealed two populations of 
enriched motifs, CA-rich motifs as well as motifs with a GGC core (GGCA and 
CGGC; Fig. 1c). The KH1–4 variant, which lacks the N-terminal RRM domains, 
showed a very similar motif enrichment as the full-length protein, revealing that the 
four KH domains recognize both types of motifs (Fig. 1c, d). Separate analysis of 
KH1–2 and KH3–4 tandem domains also showed the enrichment of GGC-core 
elements within the top-30 hexamers (Supplementary Data 1), but the most-enriched 
sequences were either CA- (KH1–2) or CA/AU-rich (KH3–4), indicating that at 
least one of the KH domains of each tandem binds such a sequence (Fig. 1c, d, for 
the enrichment of AU sequences, in particular by KH3–4, see the Discussion 
section). 
Most surprisingly, we found that RRM1–2, which until now had been described as 
nonfunctional in RNA binding, in fact exhibited a high preference for CA-rich and 
CA-repeat sequences, but not for the GGC-core elements (Fig. 1c, d). This 

---

19 
specificity was observed after the second SELEX round, but was lost with more 
stringent washing conditions within rounds 3 and 4. Therefore, only the first two 
SELEX rounds were analyzed for the RRM1–2 derivative (see Discussion). 
Furthermore, a comparison of all SELEX rounds between the complete set revealed 
that, as expected, KH1–2, KH3–4, and the longer KH1–4 variant overlap the most, 
whereas RRM1–2 showed the least overlap with the isolated KH domains 
(Supplementary Figs. 1 and 2). 
Taken together, our findings strongly argue for differential recognition of an 
extended array of two different types of motifs (CA-rich and GGC-core elements), 
which are bound by the KH tandem domains. Besides that, we provide evidence that 
the RRM1–2 domains contribute additional binding of a CA-rich element. 
A model for RNA recognition by IMP3 
To identify how the different domains of IMP3 recognize consecutive elements on 
a single RNA, we analyzed our SELEX-seq data for spacing between enriched 4-
mer motif combinations, using a window of 0–25 nts (Fig. 2a). Enriched 
combinations of two types of motifs (CA-rich and GGC-core elements) and their 
spacing 
were 
measured 
by z-score 
analysis 
(see 
Supplementary 
Data 2 and Methods). 

---

20