Mavzu: Oqsillarni identifikatsiyalash resursi (Protein Indentification Resource, pir). Reja: I kirish II asosiy qism

Mass-spektrometriya yordamida aniqlash
  Asosiy maqolalar: oqsil massasi spektrometriyasi va Peptidlarning ketma-ketligi

3. 
   Peptid bo'laklariga hazm qilish. Protein sekvensori.
   

Oqsillarni identifikatsiyalash - bu aminokislotalar ketma-ketligi asosida, qiziqish bildiradigan oqsilga (POI) ism berish jarayoni. Odatda, oqsilni genlarining DNK sekanslaridan chiqarilgan oqsillar sekanslari ma'lumotlar bazalariga asoslanib aniqlash uchun oqsillar ketma-ketligining faqat bir qismini eksperimental tarzda aniqlash kerak. Keyinchalik oqsillarni tavsiflash POI ning haqiqiy N- va C-terminalarini tasdiqlash, ketma-ketlik variantlarini aniqlash va mavjud bo'lgan har qanday translyatsiyadan keyingi modifikatsiyalarni o'z ichiga olishi mumkin.
Proteolitik hazm qilish
Proteinni identifikatsiyalashning umumiy sxemasi tavsiflangan.^[4][5]

1. 
   POI izolyatsiya qilingan, odatda tomonidan SDS-PAGE yoki xromatografiya.
   
2. 
   Sistein qoldiqlarini barqarorlashtirish uchun ajratilgan POI kimyoviy jihatdan o'zgartirilishi mumkin (masalan, S-amidometilatsiya yoki S-karboksimetilatsiya).
   
3. 
   POI peptidlarni hosil qilish uchun o'ziga xos proteaz bilan hazm qilinadi. Tripsin, lizin yoki arginin qoldiqlarining C-terminal tomonida tanlab yorilib, eng ko'p ishlatiladigan proteaz hisoblanadi. Uning afzalliklariga i) oqsillarda Lys va Arg qoldiqlarining chastotasi, ii) fermentning yuqori o'ziga xosligi, iii) fermentning barqarorligi va iv) triptik peptidlarning mass-spektrometriya uchun mosligi kiradi.
   
4. 
   Peptidlar ionlashtiriladigan ifloslantiruvchi moddalarni yo'q qilish uchun tuzsizlantirilishi va ta'sir qilishi mumkin MALDI-TOF mass-spektrometriya. Peptidlarning massasini to'g'ridan-to'g'ri o'lchash oqsilni aniqlash uchun etarli ma'lumotni berishi mumkin (qarang) Peptidning ommaviy barmoq izlari) ammo peptidlarning ketma-ketligi haqida ma'lumot olish uchun ko'pincha mass spektrometr ichidagi peptidlarning keyingi parchalanishidan foydalaniladi. Shu bilan bir qatorda, peptidlarni tuzsizlantirish va ajratish mumkin teskari faza HPLC va an-orqali mass-spektrometrga kiritilgan ESI manba. LC-ESI-MS oqsillarni identifikatsiyalash uchun MALDI-MS ga qaraganda ko'proq ma'lumot berishi mumkin, ammo ko'proq vaqt sarflaydi.
   
5. 
   Mass spektrometr turiga qarab, peptid ionlarining parchalanishi turli xil mexanizmlar orqali sodir bo'lishi mumkin. To'qnashuv natijasida kelib chiqqan dissotsiatsiya (CID) yoki Manbadan keyingi parchalanish (PSD). Har ikkala holatda ham peptidning bo'lak ionlari naqshlari uning ketma-ketligi to'g'risida ma'lumot beradi.
   
6. 
   Bashoratli peptid ionlarining va ularning parchalanadigan ionlarining o'lchangan massasini o'z ichiga olgan ma'lumotlar, keyinchalik kontseptual (silikodagi) proteolizdan olingan oqsillar ketma-ketligi va ma'lumotlar bazalarining parchalanishidan hisoblangan massa qiymatlariga mos keladi. Muvaffaqiyatli o'yin, agar uning natijasi tahlil parametrlari asosida chegara qiymatidan oshsa topiladi. Haqiqiy oqsil ma'lumotlar bazasida namoyish etilmagan bo'lsa ham, xatolarga chidamli moslik oqsilni o'xshashligi asosida taxminiy identifikatsiyalashga imkon beradi. gomologik oqsillar. Ushbu tahlilni amalga oshirish uchun turli xil dasturiy ta'minot to'plamlari mavjud.
   
7. 
   Dasturiy ta'minot to'plamlari odatda har bir aniqlangan oqsilning identifikatsiyasini (qo'shilish kodini), uning mos kelishini ko'rsatadigan hisobotni tuzadi va bir nechta oqsillar aniqlangan joyda mos keladigan kuchning o'lchovini beradi.
   
8. 
   Belgilangan oqsilning ketma-ketligi bo'yicha mos keladigan peptidlarning diagrammasi ko'pincha ketma-ketlikni qoplashni ko'rsatish uchun ishlatiladi (peptid sifatida aniqlangan oqsilning%). POI mos keladigan oqsildan sezilarli darajada kichikroq deb hisoblangan joyda, POI aniqlangan oqsilning N- yoki C-terminal bo'lagi ekanligini taklif qilishi mumkin.