Microsoft Word 60 2012 Белясова doc
Download 5.01 Kb. Pdf ko'rish
|
belyasova molekulyarnaya biotexnologiya
|
Плазмидные векторы. Для кишечной палочки создано большое
количество векторов на основе плазмидных репликонов, среди кото- рых особое распространение получили производные плазмиды СolE1, в частности pBR322 (рис. 2.4). Этот вектор сконструирован при сочетании генетических методов in vivo и методологии рекомби- нантной ДНК. Рис. 2.4. Карта плазмиды pBR322. Показаны: точка начала репликации (4362/1), гены устойчивости к ампициллину (Amp-r) и тетрациклину (Tet-r), а также сайты рестрикции для некоторых эндонуклеаз Плазмида pBR322 имеет длину 4362 п. н., ее нуклеотидная после- довательность полностью установлена. Вектор содержит гены устой- чивости к двум антибиотикам – ампициллину и тетрациклину, а также Eco RI Eco RV Pvu I Pst I Pvu II Bam HI Sph I Xma III Amp-r Tet-r pBR322 4362 п. н. 4362/1 91 12 единичных сайтов узнавания для рестриктаз (каждая из 12 рестрик- таз может расщепить молекулу только в одном сайте). Преимущества данного вектора состоят в следующем. Во- первых, он может присутствовать в клетках в большом числе копий на хромосому. Во-вторых, вектор содержит два селективных марке- ра (устойчивость к ампициллину и тетрациклину), причем внутри генов, детерминирующих устойчивость к антибиотикам, присут- ствуют сайты рестрикции для нескольких ферментов. Данное пре- имущество выражается в том, что если осуществлять встраивание чу- жеродного фрагмента ДНК в сайт, расположенный внутри гена устой- чивости, то ген инактивируется, и клетки, наследующие плазмиду с клонированным фрагментом ДНК, можно будет обнаружить по утрате устойчивости к тому или иному антибиотику. Например, если для встраивания фрагмента ДНК пользоваться рестриктазой Pst I, то на- рушится целостность гена, ответственного за устойчивость к ампи- циллину. Однако при этом сохранится устойчивость к тетрациклину, и клетки, получившие такие векторы, можно будет отобрать на среде с тетрациклином, а затем по чувствительности ко второму антибиоти- ку выявить те из них, которые содержат клонированный фрагмент. Такой прием в генетической инженерии называется инактивацией маркера в результате вставки. Существуют и другие приемы отбора клеток, воспринявших век- торы со встроенной ДНК. Один из них, например, заключается в спо- собности N-концевой части β-галактозидазы комплементировать оп- ределенную мутантную β-галактозидазу бактериальной клетки. По- ступают следующим образом. В вектор вводят часть lac-оперона E. coli, включающую промотор, оператор и 5 ′-кодирующую область гена lacZ (кодирует N-концевую часть β-галактозидазы, рис. 2.5). В эту область встраивают полилинкер, который не нарушает ни коди- рующую рамку, ни активность N-концевой части β-галактозидазы. Полилинкер представляет собой искусственно синтезированную по- следовательность, содержащую несколько сайтов рестрикции для раз- ных нуклеаз. Если в полилинкере отсутствует вставка, такой вектор- ный геном детерминирует синтез N-концевой части β-галактозидазы, которая вместе с С-концевой частью, продуцируемой специальным штаммом E. coli, образует активную β-галактозидазу. Этот фермент обеспечивает голубую окраску клеток на среде с хромогенным суб- стратом Xgal и индуктором. Если в состав полилинкера вводится чу- жеродная ДНК, нарушается комплементация, и клетки, воспринявшие рекомбинантную ДНК, образуют неокрашенные колонии. 92 У векторов, сконструированных на основе плазмидных реплико- нов, есть недостатки, основной из которых заключается в снижении числа копий на клетку при увеличении размера гибридной плазмиды. В результате клонирование фрагментов ДНК, превышающих 10 т. п. н., становится малоэффективным. Для клонирования таких крупных фрагментов ДНК используют фаговые векторы, космиды и фазмиды. Download 5.01 Kb. Do'stlaringiz bilan baham: 
|