Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Фаговые векторы. При использовании фаговых векторов жизне-
способным продуктом, содержащим рекомбинантную ДНК, является 
не популяция клеток, как в случае с плазмидными векторами, а попу-
ляция фаговых частиц. Фаговые векторы более эффективны, чем 
плазмидные, при клонировании крупных вставок. Самыми распро-
страненными для кишечной палочки являются векторы, сконструиро-
ванные на основе фагов 
λ и М13. 
Геном умеренного фага 
λ представлен двухцепочечной ДНК раз-
мером 48,5 т. п. н., которая упакована в головку в виде линейной моле-
кулы с однонитевыми комплементарными концами («липкие» концы). 
После проникновения в клетку «липкие» концы взаимно спариваются, 
молекула замыкается в кольцо и сшивается с помощью ДНК-лигазы. 
Места спаривания «липких» концов получили название cos-сайтов, они 
принимают участие в образовании фаговых геномов при репликации 
по типу катящегося кольца (подразд. 1.2, рис. 1.12). Профаг 
λ в лизо-
генных клетках находится в интегрированном с нуклеоидом состоянии 
(механизм и особенности этого явления описаны в подразд. 1.2). 
Важными для конструирования векторов являются некоторые 
особенности генома фага 
λ. Во-первых, вся центральная часть (более 
1
/
3
генома) несущественна для литического цикла, а нужна только для 
установления лизогенного состояния. Таким образом, ее можно замес-
тить на чужеродную ДНК, и при этом фаг сохранит способность лизи-
ровать клетки. Во-вторых, для успешной упаковки ДНК в головки фа-
га требуется, чтобы ее длина была более 38 т. п. н., но менее 52 т. п. н. 
В настоящее время сконструировано большое количество разно-
образных векторов на основе фага 
λ. Типичные из них содержат сайты 
рестрикции для Eco RI, ограничивающие участок генома, ненужный 
для литического цикла (рис. 2.5). При воздействии рестриктазой 
Eco RI на ДНК такого вектора образуется 3 фрагмента, среди которых 
можно отобрать концевые (содержат гены, необходимые для литиче-
ского цикла) благодаря их сравнительно большим размерам. Эти 
фрагменты смешивают с чужеродной ДНК, обработанной Eco RI, и 
получают гибридные молекулы, у которых центральная часть пред-
ставлена вставочным фрагментом (рис. 2.5). Затем полученные гиб-

---

93 
ридные молекулы упаковывают в головки фага 
λ in vitro. Для этого 
используют культуры клеток E. coli, инфицированные мутантными 
штаммами фага 
λ, один из которых имеет повреждение в гене, ответ-
ственном за процесс упаковки ДНК в головку, а второй – в гене, от-
ветственном за синтез отдельных белков головки. Такие фаги не спо-
собны обусловить литический цикл, но обеспечивают накопление в 
клетках большого количества промежуточных продуктов, необходи-
мых для сборки фаговых частиц, – пустых головок, хвостовых отрост-
ков, ферментов, необходимых для сборки. 
Рис. 2.5. Введение генов в состав векторов на основе фага 
λ 
Если экстракты таких клеток смешать с векторной ДНК, содер-
жащей вставки определенной величины, произойдет их упаковка в го-
ловки фага и сформируются зрелые фаговые частицы. На следующем 
этапе этими частицами инфицируют чувствительные клетки и полу-
чают потомство фагов с клонированными ДНК. В составе векторов на 
основе фага 
λ можно клонировать фрагменты длиной до 15 т. п. н. 
Еще одна категория фаговых векторов для E. coli базируется на 
геноме фага М13. Этот нитчатый «мужской» фаг (адсорбируется на
F-пилях) содержит одноцепочечную ДНК. Когда фаговая ДНК прони-
Eco RI
Eco RI
+ Рестриктаза Eco RI
ДНК вектора 
Фракционирование 
по размеру, удаление
центрального участка
Вставка фрагмента ДНК 
(получен с помощью Eco RI) 
Eco RI
Eco RI
Упаковка гибридной ДНК
в головки in vitro 

---

94 
кает в клетки кишечной палочки, она реплицируется с образованием 
двухцепочечных («+»/«–») промежуточных продуктов, «+»-цепи ко-
торых затем вновь упаковываются с образованием множества фаговых 
частиц. Двухцепочечный промежуточный продукт (репликативная 
форма, РФ) накапливается в клетках в количестве 100–200 копий. Его 
выделяют и используют как вектор для клонирования. Особенностью 
фага М13 является то, что он не убивает клетки, а лишь замедляет их 
деление. Частицы фага непрерывно выделяются в культуральную 
жидкость, и их титр может достигать 10
12
в 1 мл. При этом на газоне 
чувствительных бактерий фаг выявляется в виде мутных бляшек. 
В состав ДНК фага для удобства введения чужеродной ДНК 
включают полилинкеры. Когда в РФ ДНК М13 встраивается гетероло-
гичная последовательность, в фаговые частицы упаковывается только 
одна из цепей этой вставки (рис. 2.6). Одноцепочечные молекулы 
ДНК не применяют для конструирования векторов, поскольку их 
нельзя разрезать с помощью обычно используемых рестриктаз. Кло-
нируя фрагмент в М13 в обеих ориентациях, можно получить большие 
количества каждой из цепей. 
Рис. 2.6. Встраивание фрагментов ДНК в векторы на основе фага М13 
Eco RI
+ Чужеродная ДНК, 
полученная с помощью Eco RI
Eco RI 
Eco RI