Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Определение размера вставки. Размер вставки определяют с 
помощью нескольких подходов. 
Определение размера гибридной ДНК методом гель-электро-
фореза. После вычитания из полученного размера самого вектора, ко-

---

107 
торый обычно бывает известен, можно определить размер вставки. 
Чтобы получить точные данные, кольцевые рекомбинантные молеку-
лы превращают в линейные, поскольку электрофоретическая подвиж-
ность кольцевых структур зависит от степени их сверхспирализации. 
Обычно подвижность двухцепочечного фрагмента в электрическом 
поле обратно пропорциональна логарифму его размера. Используя в 
качестве маркеров фрагменты известной длины, легко определить 
размер интересующего нас фрагмента с помощью линейки. Для про-
ведения такого анализа обычно достаточно 1 мкг ДНК. Для визуали-
зации полос, содержащих фрагменты разной длины, гель окрашивают 
бромистым этидием, и в УФ-свете становятся различимы полосы 
ДНК, содержащие всего 50 нг ДНК (рис. 2.9). 
Рис. 2.9. Фото геля, в котором видны
окрашенные бромистым этидием
фрагменты ДНК (слева);
радиоавтограф геля (справа) 
Стандартные электрофоретические методы непригодны для мо-
лекул, размер которых превышает 15 т. п. н., поскольку крупные 
молекулы мигрируют в геле слишком медленно и скорость мигра-
ции уже не зависит от их размера. Для разделения таких молекул 
используют пульс-гель-электрофорез. В этом методе вместо посто-
янного однонаправленного электрического поля используется поле, 
ориентация которого многократно меняется. При этом даже очень 

---

108 
большие молекулы разделяются по размерам, что объясняется, по-
видимому, механизмом их прохождения через поры геля. Предпола-
гается, что молекулы вытягиваются в направлении поля, а затем при 
изменении этого направления переориентируются. Время переори-
ентации зависит от длины цепи и угла между направлениями поля; 
они и определяют конечное расстояние, на которое перемещается 
молекула.