Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Трансфекция – это частный случай трансформации, обозначаю-
щий проникновение в клетку нуклеиновой кислоты вируса с после-
дующим образованием вирусного потомства.
Из-за низкой частоты событий трансформации (трансфекции) не-
обходим отбор клеток, воспринявших вектор, т. е. распознавание ко-
лоний трансформантов среди большинства клонов, которые представ-
лены родительскими клетками. Для этого в составе векторов преду-
сматривают наличие специальных маркеров. В качестве таких 
маркеров используют, например, гены устойчивости к антибиотикам, 
позволяющие производить прямую селекцию трансформированных 
бактерий на среде с соответствующим антибиотиком.
Векторы, сконструированные на основе вирусов, а также космиды 
и фазмиды имеют преимущества перед плазмидными векторами, ко-
торое состоит в том, что их с высокой эффективностью удается упа-
ковывать в вирусные капсиды in vitro, а затем инфицировать ими чув-
ствительные клетки. Метод инфекции намного эффективнее транс-
формации: инфекционной становится каждая десятая молекула ДНК. 
При этом космиды и фазмиды, попав в клетки, способны поддержи-
ваться в них по типу плазмидной ДНК. 
Как известно, первым барьером на пути молекул, стремящихся 
попасть в клетку, является клеточная стенка, которая имеется у боль-
шинства организмов. Клеточная стенка обычно не пропускает круп-
ные молекулы, к числу которых относится и ДНК. Поэтому для об-
легчения процесса трансформации (трансфекции) и повышения его 
частоты можно использовать не интактные клетки, а протопласты или 
сферопласты. Однако и в этом случае процедуры получения прото-
пластов и сферопластов, трансформации их молекулами ДНК, регене-
рации клеточной стенки и отбора колоний трансформантов много-
этапны, а результат зависит от многих параметров. Все это приводит к 
тому, что данные методики отличаются низкой воспроизводимостью и 
достаточно трудоемки.
В 1982 г. Т. Вонг и Е. Нейман разработали метод электропора-
ции для введения химерных ДНК в клетки. Суть его состоит в том, 
что кратковременное воздействие (обычно 5–20 мс) электрического 
поля высокой напряженности (1–15 кВ/см) на плазматическую мем-
брану приводит к образованию в ней пор (электропробою). Время су-
ществования и размер пор достаточны, чтобы макромолекулы (ДНК) 
могли войти в клетку в результате действия осмотических сил. В оп-
тимальных условиях электропорации количество трансформантов 
может достигать 80% выживших клеток. 

---

101 
Электропорация – физический, а не химический метод, находя-
щий широкое применение для введения ДНК в разные типы клеток – 
культивируемые клетки животных, простейших, дрожжей, бактерий, а 
также в протопласты растений. 
Еще одна задача процедуры клонирования состоит в отборе кло-
нов, воспринявших именно рекомбинантную ДНК, а не просто век-
торные молекулы, которые обязательно присутствуют в смеси, полу-
ченной при включении фрагментов ДНК в состав векторов. Для реше-
ния этой проблемы используют уже описанные приемы, например 
инактивацию маркера в процессе вставки. Более прогрессивным спо-
собом отбора клонов бактерий или фагов, содержащих векторы со 
вставками, служит комплементационный анализ с использованием 
мутантных генов 
β-галактозидазы (см. выше). Применение этого ме-
тода позволяет отличать клоны бактерий (бляшки фагов), содержащие 
рекомбинантную ДНК, по цвету при высеве на среду определенного со-
става. Еще одним подобным примером служит использование гена mel 
для конструирования плазмидных векторов. Этот ген определяет 
структуру фермента тирозиназы, катализирующей превращение тиро-
зина в меланин (темная окраска колоний). При вставках фрагментов 
ДНК в кодирующую область гена mel происходит его инактивация, и 
трансформированные колонии утрачивают окраску. Существуют и 
другие приемы для быстрого поиска среди трансформированных или 
инфицированных клонов тех из них, которые восприняли рекомби-
нантную ДНК. 
Для трансформации крупных клеток животных и протопластов 
растений часто используют такой метод, как микроинъекция ДНК. 
Эту процедуру осуществляют под микроскопом с помощью специ-
ального устройства – микроманипулятора, обеспечивающего удер-
жание реципиентной клетки и введение в ее ядро капилляра с рас-
твором гибридных ДНК. Кроме этого, недавно разработано пневма-
тическое устройство (генная пушка, или генный дробовик – gene 
gun), с помощью которого можно осуществлять бомбардирование 
клеток или культур тканей микрошариками из золота или вольфра-
ма диаметром 1 мкм, на поверхность которых нанесены гибридные 
ДНК. Данный метод получил название «метод биолистики» (био-
логической баллистики). 
Кроме того, специально для трансформации растительных клеток, 
имеющих, как известно, мощные ригидные клеточные стенки и не 
поддающихся обычным методам введения ДНК, разработан метод аг-