Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Часть lac-
оперона
E. coli 

---

95 
Для удобства отбора рекомбинантных форм (фагов, в геном ко-
торых произошла вставка чужеродной ДНК) используют вставки в 
некодирующую область вектора – части lac-оперона E. coli, которая 
обусловливает комплементацию мутантной 
β-галактозидазы, и по-
лилинкер. Когда в полилинкере отсутствует вставка, фаговые час-
тицы на специальном мутантном штамме кишечной палочки в при-
сутствии индуктора и хромогенного субстрата образуют голубые 
негативные колонии. Встраивание фрагмента ДНК в вектор в облас-
ти полилинкера нарушает комплементацию, и бляшки остаются не-
окрашенными. 
Преимуществом фаговых векторов на основе М13 является спо-
собность включать очень большие вставки, поскольку в данном слу-
чае процесс упаковки ДНК не зависит от размера фагового генома. 
Самое важное применение векторов – производных фага М13 состоит 
в получении одноцепочечных ДНК-матриц для секвенирования мето-
дом Сэнгера. Кроме того, однонитевые ДНК являются идеальной ми-
шенью для сайт-специфического мутагенеза. 
Анализ изложенного выше позволяет обнаружить преимущества 
плазмидных и фаговых векторов, что послужило поводом для конст-
руирования векторов, объединяющих свойства одних и других. Это 
группа так называемых плазмидно-фаговых векторов, которая вклю-
чает космиды и фазмиды. 
Космиды. Представляют собой один из типов гибридных векто-
ров, которые реплицируются, используя плазмидный тип репликации, 
но обладают способностью упаковываться in vitro в капсиды фага 
λ. 
Иными словами, космиды представляют собой плазмиды, содержащие 
cos-участок («липкие» концы) ДНК фага 
λ. Благодаря cos-сайтам эти 
векторы могут быть введены в клетку не с помощью трансформации, 
а путем обычной инфекции, в результате чего эффективность получе-
ния рекомбинантных клеток возрастает в 100 и более раз. В космид-
ных векторах можно клонировать фрагменты ДНК размером 33–
49 т. п. н., таким образом, эти векторы предназначены для встраива-
ния крупных эукариотических генов, что имеет особое значение для 
создания клонотек эукариотических геномов. 
Примером космидного вектора служит плазмида pBR322, у ко-
торой в составе гена устойчивости к ампициллину клонированы 
cos-сайты фага 
λ. Если такой вектор расщепить рестриктазой и 
смешать с фрагментами чужеродной ДНК, полученными при воз-
действии на геном тем же рестриктирующим ферментом, может 
образоваться смесь конкатемеров. 

---

96 
Конкатемеры представляют собой длинные молекулы, в которых 
геномы фага 
λ (или замещающая их ДНК) повторяются несколько раз 
и отделены друг от друга cos-сайтами (рис. 2.7). При смешивании с 
белками, осуществляющими упаковку ДНК фага 
λ, эти конкатемеры 
разрезаются по cos-сайтам, и ДНК включается в состав капсида. Что-
бы это произошло, расстояние между двумя соседними cos-сайтами 
должно составлять 38–52 т. п. н. 
Рис. 2.7. Использование космидных векторов для клонирования 
Как и в случае с 
λ-векторами, смесь конкатемеров может вклю-
чать векторные молекулы без вставок, а также с множеством повто-
ряющихся вставок. После инфицирования клеток рекомбинантная 
ДНК поддерживается в них в виде плазмиды, детерминируя в данном 
случае устойчивость к тетрациклину.