O’zbekiston Respublikasi Oliy ta’lim, Fan va innovattsiyalar Vazirligi Mirzo Ulug’bek nomidagi

2.7 . Optik mikroskop
Konfokal va flüoresan mikroskopiya Vena biotexnologiya institutida Leica "Jonli hujayra", keng maydonli mikroskopda o'tkazildi. Namunalar tegishli tamponda ~1% v/v qattiq moddalargacha suyultirildi va 1000 × kattalashtirishda vizualizatsiya qilindi (Leica HCX PL APO 100 × 1,4 moy).
2.8 . Hujayra hayotiyligi
Mikroskopiya va miqdoriy tahlillar (Invitrogen) uchun L7012 LIVE/DEAD ^® BacLight™ bakterial yashovchanlik to'plami yashovchanlikni bo'yash uchun ishlatilgan. Inkubatsiyadan so'ng, SOD va hujayra / qatron suspenziyalarini ifodalovchi E. coli 0,9% (w/w) NaCl da 1:10 nisbatda suyultirildi. Bo'yash komponentlari SYTO 9 bo'yog'i (3,34 mM) va propidium yodid (20 mM) ning 1: 1 nisbatida oldindan aralashtirilgan ; Har bir 1 ml suyultirilgan namunaga 3 mkl binoni aralashmasi qo'shildi , kuchli aralashtirildi va qorong'i joyda 23 ° C da 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Inkubatsiyadan so'ng suspenziyalar yana aralashtiriladi va mikroskop slaydlariga 5 mL qo'llaniladi. Floresans 1000 × kattalashtirishda qizil va yashil o'tish filtri (N2.1 va L5; Leica) orqali o'lchandi va mos ravishda propidiy yodidli o'lik hujayralarni va STYO 9 bo'yalgan tirik hujayralarni aniqlash uchun.
2.9 . SDS-PAGE
Barcha namunalar 25% (v/v) 4× SDS namuna buferi (Invitrogen) va 10% (v/v) 2 M DTT qo‘shilgandan so‘ng 100 °C da 10 daqiqa davomida isitiladi . Elektroforez 8-12% poliakrilamid jellarida (Invitrogen) MES-SDS ishlaydigan buferda 200 V va maksimal 400 mA 60 daqiqa davomida amalga oshirildi. Bo'yash Coomassie R250 va Bismark BraunR (Sigma Aldrich) yordamida amalga oshirildi. Densitometriya optik gel skanerlash (Epson Perfection Scan V770, 600 dpi, 16 bit kulrang shkala) bilan amalga oshirildi va LumiAnalyst (v3.0 Roche Diagnostics, Bazel, Shveytsariya) dasturi bilan baholandi.
2.10 . GFP protein standartini tayyorlash
GFPmut3.1 protein standarti E. coli gomogenatidan tayyorlangan bo'lib , u 60 daqiqa davomida 10000 × g da santrifüj qilingan , so'ngra supernatant 0,2 mkm filtrlangan va ÄKTA tozalagichda (GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Shvetsiyadan) anion bilan ketma-ket tozalangan. almashish vositalari (GE Healthcare Life Sciences kompaniyasidan AIEX CaptoQ), gidrofobik o'zaro ta'sir muhiti (GE Healthcare Life Sciences kompaniyasidan ButylSepharose HP) va gel filtrlash (GE Healthcare Life Sciences'dan SuperdexG75 tayyorgarlik darajasi). Tozalangan oqsil 8 M karbamidda 10 minut davomida 100 ° C da denatüratsiya qilindi va konsentratsiyasi 280 nm da uning absorbsiyasidan aniqlandi . Yo'q bo'lib ketish koeffitsienti Expasy ProtParam Tool (Shveytsariya bioinformatika instituti, Lozanna, Shveytsariya) yordamida GFP aminokislotalar ketma-ketligi (MSKGEELFTGVVXILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLXVXFFXVSSQVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLXVXFFXVSCCFR) asosida hisoblab chiqilgan. ERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTXIGDGXVLLXDNHYLSTQSALSKDXNEKRDHMVLLHEFMDELAA). Tegishli lyuminestsent intensivliklari GENios Pro plastinka o'quvchi (Tecan, Maenedorf, Germaniya) da 485 nm qo'zg'alish va 535/20 nm emissiyada standart kalibrlash orqali aniqlandi.