Учебное пособие для самостоятельной подготовки к экзамену по микробиологии, вирусологии и иммунологии

129. Реакции иммунитета с участием комплемента, методы их постановки и практическое применение.
Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента в результате присоединения его к антителам, находящимся в комплексе с антигеном (реакции связывания комплемента, радиального гемолиза и др. ). Реакция связывания комплемента двухфазная; первая фаза - инкубация смеси искомого антигена (или антитела) с диагностической сывороткой (или антигеном-диагностикумом) и комплементом; вторая фаза - индикаторная - определение наличия в смеси свободного комплемента путем добавления гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела против эритроцитов барана. В первой фазе реакции при образовании комплекса антиген-антитело происходит связывание им комплемента, во второй фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов отсутствует (реакция положительная). При отрицательной реакции, если антиген и антитело не соответствуют друг другу, комплемент остается свободным и во второй фазе реакции присоединяется к комплексу эритроцит-антиэритроцитарное антитело гемолитической сыворотки, вызывая гемолиз. Реакция связывания комплемента применяется для диагностики инф. болезней, в частности сифилиса
130. Реакции иммунитета с мечеными антигенами или антителами (иммунофлюоресценции, радиоиммунный, иммуноферментный). Практическое применение.
Серологические реакции, в которых используются меченые антигены или антитела, отличаются высокой чувствительностью и находят все более широкое применение в диагностике инфекционных за­болеваний как для обнаружения и идентификации антигена в исследуемом материале, так и для обнаружения антител в сыворотке крови больных. Метят антигены или антитела флюорохромами, ферментами или радиоактивными изотопами. При этом антигены и антитела, образовывая комплексы с метками, не утрачивают способности к иммунному реагированию.
Реакция иммунофлюоресценции используется для выявления микробных или вирусных антигенов, локализованных в пораженных тканях или патологическом материале. Меченые антитела получают путем обработки иммунной сыворотки флюорохромами.
Различают два варианта постановки реакции иммунофлюоресценции:
а) Прямой метод Кунса.Метод заключается в обработке среза ткани или мазка из патологического материала сывороткой, содержащей антитела к предполагаемому антигену, меченые флюорохромом. После промывания препарата, при котором удаляются свободные антитела, его просмат­ривают в люминесцентном микроскопе. Если в препарате присутствует антиген, он свяжется с мечеными антителами, образуется комплекс, который будет давать свечение в ультрафиолетовом свете.
б) Непрямой метод Веллера и Кунса ставится в два этапа. На первом этапе препарат обрабатывают диагностической иммунной сывороткой. На втором этапе -
люминесцирующей антисывороткой. При положительном результате
образуется иммунный комплекс, состоящий из антигена, антител к нему
и меченых антиглобулинов, этот комплекс будет светиться в ультрафиолетовых лучах.
Метод иммунофлюоресценции применяют для: 1) индикации и идентификации гетеро- и аутоантигенов (бактерий, вирусов, грибов); 2) доказательства выработки антител определенной специфичности (выявление антител к ДНК, тканевому антигену щитовидной железы); 3) доказательства реакции антиген+антитело в тканях (при сывоточной болезни, гломерулонефрите и т.п.); 4) выявления антител в сыворотке крови.
Радиоиммунный метод
Для метки антигена или антитела используют радиоактивные изотопы Применение радиоактивной метки возможно, если меченные антигены и антитела сохраняют способность взаимодействовать друг с другом. Метод более чувствителен, чем предыдущий, точен при количественной оценке антигена или антитела.
Реакцию учитывают путем измерения радиоактивности в образовавшемся комплексе антиген+антитело. При постановке реакции используют модификации:
А) Классический радиоиммунный метод. Метод основан на конкуренции за антитело между меченным стандартным антигеном и немеченым антигеном, содержащимся в исследуемом материале.
Эта модификация нашла широкое применение не только при решении иммунологических проблем, с ее помощью можно обнаружить минимальные количества некоторых веществ в биологических жидкостях, например, инсулина.
Б) Техника «твердая фаза». В данной модификации антиген или антитело адсорбируют на поверхности полимеров: полистирола, полиэтилена, сефадекса и др. В зависимости от характера реакции различают следующие методы:
1) методы, основанные на конкуренции антигенов. Принцип метода заключается в том, что определяемый и меченный антигены конкурируют за антитела известной концентрации, осажденные на сорбенте. Чем больше антигена содержится в исследуемом материал, тем больше антител с ним свяжется, тем меньше меченого антитела будет на субстрате. На этом принципе основано определение IgЕ, ряда гормонов, лекарственных веществ.
2) неконкурентные методы. Принцип заключается во взаимодействии антигена (или антитела) и антителами (или антигенами) известной специфичности, адсорбированными на сорбенте, после чего к ним добавляют меченые антиглобулины и после инкубации определяют содержание радиоактивных реагентов. Данный тест в практике используется для определения HBs-антигена.
3) «Сандвич-метод» представляет собой модификацию «неконкурентных» методов. Принцип заключается в инкубации определенного антигена с антителами к нему, после отмывания не связавшихся антител, смесь обрабатывают соответствующей меченой антисывороткой, после чего оценивают количество антигена с помощью счетчика. Этим методом можно обнаружить содержание IgЕ, антигена гепатита В, антигенов гистосовместимости, антител к ДНК.
Особой формой метода является авторадиография, заключающаяся в обработке срезов тканей мечеными антителами известной специфичности. Метод позволяет определить локализацию антигена, например, мембранных рецепторов лимфоцитов.
Иммуноферментный метод
Разработаны различные варианты метода в зависимости от вида фермента и системы антиген – антитело. В качестве ферментных меток применяют щелочную фосфатазу, пероксидазу из хрена, β-галактозидазу.
Для количественного анализа применяют две модификации ИФА.
В первой модификации антиген, меченный ферментами, конкурирует с немеченым исследуемым антигеном за связывание с антителами и ферментная активность обратно пропорциональна количеству антигена в исследуемом материале. Во второй модификации конкурентные отношения отсутствуют.
Преимуществом метода является отсутствие контакта с радиоактивными веществами.
В настоящее время метод ИФА очень широко применяется в различных отраслях медицины. Широко им пользуются в вирусологии для выявления вирусных антигенов или антител к вирусам. Разработаны тест-системы ИФА для выявления стафилококковых энтеротоксинов, дифтерийного токсина, антител к пневмококку и т.д.