Фибриллы внеклеточного матрикса состоят из белков коллагена (до 30% массы всех белков организма), фибронектина и эластина, а также, в случае кости, из кристаллов фосфата кальция

3.4. Выделение и культивирование клеток
Выделенные из организма клетки в новых для них искусственных условиях сохраняют свой геном, тогда как фенотипические признаки (размер, скорость роста, экспрессия генов, функциональная активность, чувствительность к лекарствам, метаболизм, состав мембран и т.д.) начинают меняться в зависимости от условий выращивания. Поэтому при культивировании клеток в условиях in vitro стараются искусственную среду создавать таким образом, чтобы она в максимальной степени соответствовала условиям in vivo. Например, каждая клетка в составе ткани находится в окружении других нескольких типов клеток, которые имеют сложную структуру внеклеточного матрикса, пронизаны сетью сосудов и нервов (рис. 1.11).

Рис. 1.11. Схема структурной организации соединительной ткани in vivo из разных типов клеток (фибробласты, жировые клетки, макрофаги и другие лейкоциты), типов волокон (1 — эластичные, 2 — ретикулярные и 3 — коллагеновые), нервов и сосудов, заключенных в гидрогель из полисахаридов.

Фибриллы внеклеточного матрикса состоят из белков коллагена (до 30% массы всех белков организма), фибронектина и эластина, а также, в случае кости, из кристаллов фосфата кальция. Синтез компонентов матрикса осуществляют разные группы клеток и, особенно, специализирующиеся на этом фибробласты. Входящие в состав матрикса длинные полисахаридные ветви протеогликанов удерживая жидкость, в большей части внеклеточного пространства формируют гидрогель. Очевидно, что воспроизвести такую трехмерную структуру in vitro пока практически невозможно.
Очевидно, что подобная структура ткани накладывает свое ограничение на способ выделения из нее отдельной клетки, - необходимо разрушить внеклеточный матрикс и разорвать связи между клетками таким образом, чтобы освободившиеся клетки не были разрушены (рис. 1.12).
Другой способ основан на том, чтобы из помещенного в культуральную среду куска ткани сами клеток постепенно выходили в окружающее пространство. Этот тип культуры называется эксплантом. Некоторые ткани (кровь и их предшественники в костном мозге) лишены внеклеточного матрикса, что существенно упрощает процедуру выделения и формирования на их основе, например, стволовой клетки крови (гемопоэтической СК).

Рис. 1.12. Схема выделения клеток из ткани.

Независимо от схемы выделения клеток из ткани, вся процедура включает в себя следующие основные манипуляции:

1. 
   фрагмент ткани измельчают механически;
   
2. 
   обрабатывают расщепляющими внеклеточный матрикс протеазами (трипсином, коллагеназой, гиалуронидазой, папаином или их комбинациями);
   
3. 
   в среду вводят кальций-связывающие соединения (хелаторы) для снижения клеточной адгезии и ослабляющие связь клеток между собой и с внеклеточным матриксом;
   
4. 
   водят ДНКазу для предотвращения склеивания клеток в тягучие сгустки за счет электростатических взаимодействий с высвободившейся из поврежденных клеток ДНК;
   
5. 
   клетки отделяют от обломков матрикса (дебриса) центрифугированием и/или фильтрацией
   
6. 
   клетки высаживают в культуральные флаконы или чашки Петри в питательную среду из физиологических солей, буфера pH, аминокислот, витаминов и глюкозы, а также белковых ростовых и питательных факторов;
   
7. 
   клетки культивируют в оптимальных для них условиях атмосферы по СО₂, O₂ и близкой к 100% влажности.
   

До начала пассирования, вновь выделенные из ткани клетки называются первичными культурами. Для них характерно то, что они представлены тем типом клеток, который соответствует ткани, откуда были получены, гетерогенны и характеризуются низкой пролиферацией. Пассирование позволяет продлить время существования культуры для последующего клонирования, исследования и сохранения свойств клеток.
По мере пассирования популяции клеток становятся более однородными, доля специализированных клеток падает. Формирование постоянной линии культуры клеток происходит без ее превращения в злокачественную, подобно «бессмертным» клеткам опухолевой ткани. После нескольких пассажей нормальная линия клеток погибает, либо трансформируется в постоянную клеточную линию, для которой характерны:

• 
  морфологические изменения (уменьшение размера клеток, снижение их адгезивности, округление, увеличение ядерно/цитоплазматического отношения),
  
• 
  увеличение скорости роста (время удвоения клеток в культуре снижается с 36 - 48 до 12 - 36 часов),
  
• 
  снижение зависимости от сыворотки,
  
• 
  увеличение эффективности клонирования,
  
• 
  снижение зависимости от субстрата,
  
• 
  увеличение гетероплоидности (хромосомные различия между клетками) и анеуплоидности;
  
• 
  увеличение опухолеродности.
  

Клетки одного и того же типа в составе ткани взаимодействуют друг с другом и согласовывают скорость деления с тем чтобы поддерживать надлежащую плотность популяции. Например, при повреждении эпителия, клетки по краям раны начинают делиться, закрывая место повреждения. Когда место травмы закроется, пролиферация и движение клеток прекращаются. Это явление наблюдается в культуре фибробластов in vitro. В присутствии сыворотки они связываются с внутренней поверхностью сосуда и делятся до образования сплошного монослоя, где соседние клетки соприкасаются друг с другом. Когда культура станет монослойной, движение клеток прекращается, и нормальные клетки перестают делиться, - явление зависимого от плотности торможения пролиферации. Плотность клеточной популяции, при которой клетки в сплошном монослое перестают делиться, увеличивается с повышением концентрации факторов роста в среде. Показано, что в питательной среде такой культуры клеток падает содержание питательных веществ и (или) факторов роста. Например, один из факторов роста, обычно, присутствует в среде в концентрации около 10^-10 М (примерно одна молекула в объеме сферы диаметром 3 мкм) для фактора роста, каждый из фибробластов имеет около 10⁵ рецепторов. То есть, рецепторы каждой клетки могут связать все молекулы факторов роста в сферы диаметром около 150 мкм.