2-kurs 321-guruh talabasi Raxmatova Fayoza Mavzu: ngs(Next-Generation Sequencing) sekvenirlash

Variantni Chaqirish

Shaxsiy genomlarni ketma-ketlashtirishdan amaliy foydalanish ma'lumotlarni tahlil qilishdir. Odatda amalga oshiriladigan tahlil turlaridan biri bu variantni chaqirishdir. Nomidan ko'rinib turibdiki, variantni chaqirish-bu nomuvofiqlik SNP yoki xato bo'lsa, statistik tahlilga asoslangan holda aniqlash usuli. Ilgari chuqur ketma-ketlik kutubxonalarida muhokama qilingan holda, ko'proq o'qish ko'pincha variantlarni chaqirishga bo'lgan ishonchga tenglashadi. Variant kasb dasturlari ba'zi misollar o'z ichiga oladi: FreeBayes, samtools dan mpileup, GATK yagona Genotyper, GATK Haplotype qiluvchi, va Platypus. Variant qidiruvchilar hizalama dasturi tugagandan so'ng ishlatiladi. Hizalama dasturidan chiqarilgan mos yozuvlar genomiga moslashtirilgan o'qishlarni o'z ichiga olgan BAM fayli tahlil quvuridagi variant qidiruvchilarga kirish bo'ladi. Variantli qo'ng'iroq qiluvchilarning chiqishi odatda variantli qo'ng'iroq formati (VCF) fayli bo'lib, har bir variant vcf faylida chiziq sifatida ko'rsatilgan. Bu BED fayl formatiga deyarli o'xshaydi, lekin ular bir xil emas. Bundan tashqari, aksariyat dasturlar chaqirilgan variant holatida hizalanadigan o'qishlar sonini chiqaradi.

Variantni chaqirish-bu NGS-dan FASTQ fayllaridan boshlanadigan va chaqirilgan variantlarning VCF fayli bilan tugaydigan o'z-o'zidan tahlil quvuri. Ushbu quvur liniyasiga erishish mumkin bo'lgan turli xil dasturlar mavjud, ammo biz misol quvurini muhokama qilamiz. Bizning misolimizda quvur liniyasidagi birinchi qadam Fastq faylini Fastq Groomer vositasi bilan Phred score kodlash sxemasini Sanger/Illumina 1.9 kodlashiga qayta formatlash uchun ishlatishdir. Bu bizning Phred ballar keyingi vositasi foydalanish imkoniyatiga ega bo'lgan sxema uchun kodlangan ishonch hosil qilish uchun zarur bo'lgan. Keyingi qadam, past sifatli ballarga ega bo'lgan barcha o'qishlarni (yoki ma'lum parametrlarga qarab mintaqalarni) olib tashlash uchun tayyorlangan FASTQ faylini FASTQ Trimmer yoki Trimmomatic bilan kesishdir. Bu bizni moslashtirishda muvaffaqiyat qozonadi. Birinchi va ikkinchi bosqichlar orasida FASTQC vositasi yordamida o'qish sifatini tekshirishning muhim bosqichi. Qabul qilingandan so'ng, uchinchi qadam tozalangan va kesilgan FASTQ faylini mos yozuvlar genomiga moslashtirishdir Boutie2, bva, yoki HISAT2. Agar kerak bo'lsa, to'rtinchi qadam SAM-dan BAM fayliga aylantirishdir. Agar kerak bo'lsa yoki kerak bo'lsa, beshinchi qadam bam faylini genomik mintaqaga filtrlashdir, bu vaqtni tejaydi. Oltinchi qadam, agar kerak bo'lsa, bam faylini saralashdir. Ettinchi qadam-a yordamida variantlarni chaqirish uchun hizalangan BAM faylidan foydalanish variant chaqiruvchi, kabi FreeBayes. Variantli qo'ng'iroqdan so'ng, variantlar gen yoki oqsil funktsiyasiga qanday ta'sir qilishini taxmin qilish uchun izohli ma'lumotlar bilan baholanishi mumkin, bu ham Galaxy orqali mavjud.

Quyida siz umumiy qadamlarni topishingiz mumkin. Ushbu vositalarning barchasi Galaxy-da mavjudligini unutmang, bu ba'zi qadamlarni kamaytiradi, chunki Galaxy chiqishda foydalanish uchun ma'lum vositalarni avtomatlashtirgan.

1. FASTQ Groomer: Sanger/Illumina uchun FASTQ fayllarni qayta formatlash 1.9

2. FASTQ Trimmer / Trimmomatic: past sifatli ballar bilan viloyatlarini yuz 
bezak 3. Boutie2 / bva / HISAT: o'qishlarni mos yozuvlar genomiga tekislang 
4. SAM-to-BAM: agar kerak bo'lsa, chiqishni hizalamadan aylantiring. Agar Galaktikadan foydalansangiz, bu kerak emas.
5. BAM filtri: vaqtni tejash uchun bam faylini xromosoma yoki genomik mintaqa bilan cheklang. Bu ixtiyoriy.
6. Saralash BAM: bu ixtiyoriy emas, Galaxy yordamida bo'lsa, lekin kerak emas. 
7. FreeBayes: variantlarni chaqirish uchun hizalangan BAM faylidan foydalaning!