2-kurs 321-guruh talabasi Raxmatova Fayoza Mavzu: ngs(Next-Generation Sequencing) sekvenirlash

Applied Biosystems/SOLiD

Applied Biosystems tomonidan ishlab chiqilgan SOLiD (Supported Oligonucleotide Ligation and Detection System 2.0) platformasi ligatsiyaga asoslangan qisqa o'qishlarni sekvensiyalash texnologiyasi. Usul Jorj cherkov laboratoriyasida taklif qilingan va 2005 yilda nashr etilgan. Usulning mohiyati genomik DNKning kichik bo'laklarining nukleotidlar ketma-ketligini (25-75 p.o.) aniqlashdan iborat; magnit boncuklarda emulsiya PCR uchun zarur bo'lgan[en] adapterlari bog'langan^[17].

Poloni ketma-ketligi

Asosiy maqola: Poloni ketma-ketligi
Millionlab qisqa immobilizatsiyalangan DNK ketma-ketliklarini o'qish uchun elektroforetik ajratishsiz NGS texnologiyasi. Usulning asosiy g'oyasi tasodifiy tartibda ketma-ketlashtiriladigan ko'plab noyob "poloniyalar" (polimeraza tomonidan hosil qilingan molekulyar koloniyalar) ni yaratishdir. Poloni ketma-ketligi juftlashgan so'nggi teglar kutubxonasi (paired-end teglari) uchun amalga oshiriladi: har bir DNK molekulasining uzunligi 135 tayanch juft (p.o.), umumiy ketma-ketlik bilan ajratilgan va yonma-yon joylashgan 17-18 p. o. uzunlikdagi ikkita tegni o'z ichiga oladi^[18][19].

Bir molekulali ketma-ketlik

Asosiy maqola: Helicos Biosciences
Heliscope (Helicos BioSciences) tomonidan ishlab chiqilgan birinchi yagona molekula sekvensiyasi usuli kuniga taxminan 1 Gb ishlashga ega. Ishlash printsipi: namunani klonal kuchaytirgandan so'ng, DNK parchalanishi sodir bo'ladi, so'ngra 3'uchida poliadenillanish sodir bo'ladi, keyingi ketma-ketlik namunalarni lyuminestsent yorliqli nukleotidlar bilan yuvish bilan almashtiriladi^[20]. 2012-yilda kompaniya bankrot deb topildi va mavjudligini oldindan belgilab qo'ydi^[21], ammo 2013-yilda tashkil etilgan SeqLL texnologiya litsenziyasini oldi^[22].

DNA nanoball sequencing

Nanobariklarni yaratish va ularni substratga biriktirish
Ushbu usulda ketma-ket DNK bo'lagiga 4 ta adapter ketma-ket kiritiladi, buning natijasida PHI29 DNK polimeraza^[en] (rolling circle replication) bilan keyingi replikatsiya jarayonida sintezlangan DNK molekulasi DNK nanosariklariga katlanadi. Keyin nanoshariklar DNKni bog'lash uchun ~300 nm o'lchamdagi ko'plab maydonlarga ega bo'lgan substratga qo'llaniladi, ular panjara shaklida tashkil etilgan. Ushbu maydonlarning tashkil etilishi DNKning substratga tasodifiy qo'llanilishiga nisbatan (masalan, Poloni ketma-ketligida bo'lgani kabi) substratga ko'proq DNKni joylashtirish va tasvirdagi ma'lumot zichligini oshirish imkonini beradi^[23].

cPAL

Combinatorial probe anchor ligation-bu zond hovuzini duragaylash va bog'lash kombinatsiyasidan foydalangan holda ketma-ketlikning kombinatsiyalangan usuli. Har bir zond to'qqizta asosdan iborat bo'lib, ular o'qiladigan bitta pozitsiyadan tashqari hamma joyda degeneratsiyalanadi (ya'ni to'rttadan biri bo'lishi mumkin). Qiziqish pozitsiyasi har bir azot asosiga mos keladigan to'rtta bo'yoqdan biri bilan belgilanadi. Ankraj ketma-ketligi, qo'shimcha adapter va zondlar matritsaga gibridlanadi. Ankraj ketma-ketligining uchlaridan biriga qarama-qarshi gibridlangan problar keyinchalik bog'lanadi. Gibridizatsiya va ligatsiyadan so'ng, ortiqcha problar yuviladi va tasvir olinadi. Keyin butun ankraj-zond kompleksi yuviladi va jarayon boshqa pozitsiyalar uchun zondlar yordamida takrorlanadi. 5 ta qo'shni bazani o'qigandan so'ng, jarayon beshta qo'shimcha degenerativ asosga ega bo'lgan langarlar yordamida takrorlanadi, bu adapterning har ikki tomonida 10 tagacha bazani ketma-ketlashtirishga imkon beradi. Hammasi bo'lib, o'qish asl qismdan 70 ta asosni, adapterning har bir uchida 35 ta asosni ketma-ketlashtiradi. Adapterlar orasidagi masofa tufayli bu 35 asosli ketma-ketliklar qo'shni emas, chunki ular ikki asosli gap va besh asosli gapni o'z ichiga oladi^[24].