Аффин хромотографияси

1- расм. Полиамид асосли сорбентни олиниши


Трипсинни йўқотиш учун биомаҳсус сорбентнинг олиниши. Юқорида кўрсатилган усул билан олинган биологик сорбент асосида, биомахсус сорбент синтез қилинди. Бунинг учун полиамид кукунни 4,0 н кислотада, 45⁰С ҳароратда, инкубация қилиш билан 2 соат давомида фаоллаштирдик. Сорбент таркибидаги кислота қолдиғини дистилланган сув билан ювиш орқали кетказдик. Кейин эса, буфер эритмасида нейтрал рН гача ювдик.
Бифункционал боғламлар модификациясини эса фаоллашган полиамидни инкубациялаш орқали, 0,1 М борат буферда (рН 9,0 1г ташувчида) таркибида 0,5 мл 12,5% бўлган глутар альдегиднинг сувли эритмасида, 24 соат давомида 20⁰С ҳароратда, тинмай аралаштирган ҳолда амалга оширдик.
Ортиқча бифунционал агентни йўқотиш учун ташувчини дистилланган сув билан ювдик. Модификациядан кейин, 59 мг ингибитор трипсинни 0.1М борат буфер рН 9.0 да эритиб, сўнг 1г ташувчига қўшиб, инкубация қилдик. Инкубацияни 24 соат давомида тинмай аралаштириш орқали амалга оширдик. Боғланмай қолган трипсин ингибиторини, сорбентни (0.1м хлорли натрий эритмаси) ювиш орқали кетказдик.


4.2. Иммобилланган кефалин асосида сорбент синтез қилиш.
Биомахсус адсорбентлар липолитик ферментларни тозалаш учун аввалдан қўлланилиб келинган. Лиганд сифатида ёғ кислоталар, ташувчи сифатида эса, кўп ҳолларда полисахарид материаллари ишлатилган. Аммо, бу материаллар ўзига хос камчиликларга эгадир. Шу сабабли, лиганд сифатида, биз фосфолипазанинг субстратларидан бири фосфадитилэтаноламиндан, (кефалин) фойдаланишга қарор қилдик. Бундай адсорбентнинг ўзига хослигини нафақат фосфолипазаларда, хусусан, кефалин билан яхши боғланадиган липазаларда ҳам кўришимиз мумкин. Гарчи, улар самарали гидролизни амалга ошира олмаса ҳам, авваллари табиий фосфолипидлар лигандлар сифатида қўлланиши мумкинлиги кўриб чиқилмаган. Бироқ, тадқи қотлар шуни кўрсатдики, аминогуруҳлар бўйича субстратлар ва полимерлар ўртасидаги ковалент боғланишнинг ҳосил бўлиши шунга олиб келдики, натижада субстрат фосфолипаза А₂ , С ва Д ферментлари таъсирида гидролизланмади. Шу тариқа уларни тозалашни амалга оширишда, иммобилизацияланган кефалинли сорбентлар қўлланилди ва биомахсус хроматография учун ишлатилиши мумкин деб топилди. Бунда реакцияга қодир кефалин NH₂ -гуруҳи полиамид билан осонгина ковалент боғланади. Ферментнинг каталитик хусусиятини намоён қилишда, ажралаётган боғламлар билан бевосита яқин бўлган гуруҳнинг кимёвий табиатини баҳолаш имконини берувчи фосфолипаза А₂, бундай тадқиқотлар учун энг қулай модель ҳисобланади. Шунинг учун бифункционал диальдегидлар (глутар диальдегид, госсипол) ёрдамида “бириктириш” жараёнини ўтказиш мумкин.
Ўтказилган тажрибалар шуни кўрсатдики, фосфатидилэтаноламин ва фосфолипаза А₂ ларнинг фаоллаштирувчиларсиз бирга инкубацияси, гидролизга олиб келмайди. Реакцияни амалга ошириш учун, зарур шартлардан бири, модификаторларнинг реакцион муҳитда албатта мавжуд бўлишидир.
Шундай қилиб, ҳақиқатдан ҳам полимер билан бириккан фосфолипид малекулалари, энзиматик деградацияга учрамайди. Биомахсус адсорбентнинг синтези глутар альдегид ёрдамида NH₂ гуруҳлардан фойдаланган ҳолда, лигандни ташувчига бириктириши орқали амалга оширилди. Сорбент модификациясини хона ҳарорати шароитида 2,5% глутар альдегид билан 2 соат давомида инкубация қилиш билан ўтказилди. Кейин эса, фосфатидилэтаноламинни ковалент боғлаб, инкубация қилиш йўли билан 48 соат давомида, 4⁰С ҳароратда амалга оширилди. Бунда боғланган лигандларнинг сони 1гр ташувчига 58 мгни ташкил қилди.
Ташувчиларнинг фаол альдегид гуруҳларидаги ўзига хос бўлмаган ўзаро таъсирчанлигини йўқотиш учун, лиганд билан бирикишдан бўш қолган ташувчи қисми, (рН 8,0, 9,0) этаноламин билан блокирланади. Синтезланган биомахсус сорбент, кимёвий жиҳатдан инерт ҳисобланиб, унчалик турғун эмас. Шу сабабли сорбентнинг қўшимча турғунлиги, натрий боргидрит ёрдамида, ишлов бериш билан амалга оширилади. Сорбентни биомахсус храмотографияда, липолитик ферментларни тозалашда ишлатиш мумкин. Бунда ферментнинг ҳар бир тури учун сорбция ва десорбциянинг аниқ шартлари ишлаб чиқилиши зарур.