Аффин хромотографияси

3 - жадвал


Биоспецифик сорбентдаги Д фосфолипазасининг десорбциясига
элюция шартларининг таъсири

Вариант №	Элюция шартлари	Фермент десорбцияси, бирикиш ҳисобидан %
		Фаоллигига қараб	Оқсилга қараб
1	10^0 С ҳароратда таркибида 30 мМ Са^2+ ва 1 М KCl 0.05 М натрий – ацетат буфер рН 5.6	Йўқ	75
2	Таркибида 3 мМ Са^2+ ва 1 М KCl 0.05 М натрий – ацетат буфер рН 5.6	Йўқ	Йўқ
3	Натрий – ацетат буфер рН 5.6	–	–
4	Худди шу буфер, таркибида 20 % ли этиленгликоль билан	–	–
5	Худди шу буфер, таркибида 20 % ли глицерин билан	–	–
6	0.05 М трис–HCl–буфер, рН 9.6	85	15

Фосфолипазани бу манбадан шунингдек, пахта уруғи ва карам баргларидан ажратиб олиш ва тозалаш натижалари 4-жадвалда берилган. Кўриниб турибдики, барча ҳолатларда фосфалипатик фаолликка эга уч турдаги фракцияни олиш мумкин. Ферментнинг ажратиб кўрсатилган шакллари иммобиллашган фосфатидилэтаноламинга яқинлиги ва максимал чегараланган фаолликнинг катталиги билан ажралиб туради. Уларнинг тозаланиш босқичлари 215 дан 370 мартагача ётади. Бу ўз навбатида худди шу манбалардаги фосфолипазани тозалаш даражасидан юқорилигини кўрсатади.

5-расм. Турп илдизларидан олинган фосфолипазанинг биоспецифик адсорбцион хромотографияси. Аффин хромотографиясини ковалент боғланган фосфотидилэтаноламин, модификация қилинган капрон колонкасида ўтказишган. А, Б – №2 ва №4 вариантлар шароитидаги фермент адсорбцияси, бунга мутаносиб тарзда келгусида колонка орқали бирламчи буферни ўтказиш; (2-жадвалга қаранг); В – №8 вариант шароитидаги адсорбцияли ферментнинг препаратив тозаланиши (2-жадвалга қаранг) келгусида рН чизиқли градиентли (рН 5,6 дан рН 9,5 гача) элюцияси билан; 1–оқсил; 2–фаоллик; 3–рН градиент. Йўналишли чизиқлар билан элюциянинг бошланиши ва бириккан фаол фракциялари кўрсатилган I, II, III шакллари; А₁–фосфотидилхолиндаги холин шаклланиши тезлигига қараб ҳисобланган чегаравий фаоллиги.

Д фосфолипазанинг бўлинган шаклларининг гомогенлиги уларнинг сорбентдан элюциясидан кейин полиакриламинд гелдаги дискэлектрофорез методи орқали кўрсатилган (6-расм). Кўриниб турибдики, ферментнинг ажратилган шакллари оқсилларнинг асосий қисми ягона чизиқда локаллашган.

а) б)

Чизиқ кенглиги, см

6-расм. 7.5 % ли полиакриламид гелида I (a( III (б) фосфолипазалар формаларининг диск – электрофорездан кейинги денситограммаси

Асосий чўққига йўлдош бўлган оқсил чизиқларни молекуляр оғирлигига қараб фарқланадиган фермент шаклларининг борлиги билан тушунтириш мумкин. Шаклнинг бўлиниши электрофоретик ҳаракатчанликка қараб фарқланади:

Шуни аниқлаш жоизки, Д фосфолипазасининг фаоллигига эга бу фракциялар ферментнинг конфомерлари бўла оладими йўқми? Бунинг учун бўлинган рН форматларнинг ферментатив фаоллиги Ca²⁺ концентрацияси, субстрат, ҳарорат, α муносабатга боғлиқлиги аниқланади, яъни шундай факторларки, уларнинг таъсири ферментнинг икки шакли учун турлидир.

Шундай қилиб, ўтказилган тадқиқотлар асосида қуйидагича хулоса қилиш мумкин: 1) полиамид сорбентда фосфатидилэтаноламир билан ковалент боғланган Д фосфалипазасининг биоспецифик хромотографияси учун оптимал шартлар аниқланган; 2) Тақдим этилган биоспецифик