Аффин хромотографияси

4.3 Фосфолипаза А₂ ферментини
биоспецифик усулда тозалаш
А₂ фосфалипазасининг ўрганилишига ва уни турли биологик манбалардан ажратиб олишнинг самарали методлари ишлаб чиқилиши ҳозирги кунда тадқиқотчиларнинг катта эътиборини тортмоқда. Энг аввало, бу ферментнинг биологик мембраналарнинг вазифаларини ва тузилишини тадқиқ этишда зонд сифатида кенг ишлатилиши сабаблидир. Бундай тадқиқотлар ўтказиш учун одатда илонлар ва ҳашоратнинг заҳари ёки сувли эритмаларда юқори доимийлик билан ажралиб турувчи пенкреатик темирлардан олинган А₂ фосфолипазасини ишлатишади.
Гелнинг фильтрация ва ион алмашинувчи хромотография усуллари асосида оқсилларни фракцияларга бўлиш йўли билан бундай объектлардан фосфолипазаларни ажратиш ва уларни тозалашнинг турли схемалари мавжуд. Кўпчилик ҳолатларда бу методлар кўп босқичли бўлади ва унча кўп бўлмаган тозаланган ферментни беради. Биокимёвий амалиётга аффин хромотографияси методлари киритилгандан сўнг янада яхши натижаларга эришилди. Бу эса ферментнинг турли лигандлар билан комплекс ҳосил қилувчанлик механизмлари ҳақидаги ахборотларни олиш имкониятини яратди. А₂ фосфолипазанинг Crotalus adamanteus илони заҳридан тоза ҳолда олишнинг бир босқичли усули ишлаб чиқилган ва бу усулда АН сефароза 4В нинг субстратли аналог билан ковалент ҳолатда боғланган аффин хромотографиясидан фойдаланилади. Фосфолипаза А₂ нинг Ўрта ОСиё кобраси Naja naja oxiana дан 4В сефарозада иммобилланган антителаларда биоспецифик хромотографияни қўллаш орқали тозалаб олишнинг усули маълум.
Фосфолипаза А₂ ни оқ-қора кобра Naja melanuluca дан олиш ва уни заҳар таркибида мавжуд полипептид – кардиотоксиндан ажратиш учун фенилсефарозали СL – 4B колонкасида гидрофоб хромотография методи ишлаб чиқилган. Бу методларнинг умумий камчилиги етарли тирқишларга эга бўлмаган ва микроорганизмларнинг бузувчи таъсирида бузилган полисахарид табиатига эга ташувчиларнинг қўлланилишидир. Бундай типдаги ташувчиларга лигандларнинг бирикиши бром цианиднинг активланишини талаб этади, бу эса бу турдаги адсорбентларни қўллашни умуман чеклаб қўяди. Булардан ташқари, юқорида келтирилган кўплаб сорбентларнинг синтези, кўпчилик ҳолатларда қўлланиладиган лигандларни олишдаги юқори қийинчиликларнинг ҳисобига жуда мураккаб масала ҳисобланади. Маълум аффин сорбентларнинг рухсат берилиш хусусияти А₂ фосфолипазасининг турли формаларини ажратиш учун етарли бўлмайди. Ушбу ишнинг асосий мақсади фосфолипаза субстрати – фосфатидилэтаноламинни полиамид ташувчига бифункционал боғланиш – глутар альдегиди билан ковалент бириктирилиши орқали синтезланган адсорбентда биоспецифик хромотографияни қўллаган ҳолда турли манбаалардан А₂ фосфолипазаларинининг турли формаларини ажратишнинг самарали методларини ишлаб чиқиш ҳисобланади. Олдин бу сорбент Д фосфолипазанинг молекуляр формаларини ажратиш ва уларнинг тозаланиши учун муваффақиятли қўлланилган эди.