Аффин хромотографияси

7 – жадвал


Биоспецифик адсорбцион хромотографияни қўллаган ҳолда турли манбаалардан олинган фосфолипаза А₂ ни тозалаш

Тозалаш босқичи	Оқсил мг	Фаоллик		Чиқиш, %	Тозалаш босқичи, марта
		Умумий, бирлик	Солиштирма, бирлик/мг
I. Ошқозон ости бези Бошланғич гомогенат иссиқли қайта ишлаш рН 4.0 диализ биоспецифик хромотография	1280 - 92 5.8	3840 - 2940 2349	3 - 32 405	100 - 76.5 61.17	1 - 10.6 135
II. Кобра заҳари Дастлабки заҳар Биоспецифик хромотография Форма I Форма II Форма III	50.0 12.4 2.7 7.5 2.2	124100 116654 11340 96795 8519	2402 - 4200 12906 3850	100 94 9.1 78.1 6.8	1 - 1.7 5.3 1.6
III. Чўл қора илони заҳари Дастлабки заҳар Биоспецифик хромотография Форма I Форма II Форма III Форма IV Форма V Форма VI Форма VII	44.0 12.8 1.90 1.94 1.00 2.76 2.16 1.94 1.10	97240 95902 2161 5000 4101 7524 22568 34660 19886	2210 - 1137 2577 4060 2726 10448 17865 18080	100 98.6 2.2 5.1 4.2 7.7 23.2 36.6 19.6	1 - 0.51 1.17 1.84 1.23 4.72 8.08 8.18
IV. Катта қовоғари заҳри Лиофилланган заҳар Биоспецифик хромотография Форма I Форма II Форма III	18.0 2.08 1.01 0.65 0.42	6480 3912 2153 1081 678	360 - 2127 1660 1622	100 64 33 17 14	1 - 6.0 4.6 4.5

Кобра заҳаридан олинган фосфолипаза А₂ ни тозалаш бўйича тажрибалар натижалари 7б-расм ва 7-жадвалда келтирилган. Келтирилган маълумотлар кўрсатилишича, ушбу ҳолатда кобра заҳаридан олинган оқсилларнинг асосий қисми (80 %) адсорбент билан боғланмайди ва фосфолипаза А₂ активлигига эга эмас. Биргина хромотография жараёнида лиганднинг ёғ кислоталар қолдиқлари билан гидрофоб боғланишлари ҳисобига уларнинг бўлиниши кузатилади. Колонканинг тритон Х–100 концентрация градиенти билан ювилишида адсорбентдан 3 та аниқ кўрсатилган фаоллик нуқталари бўйича элюирланади, буларда эса деярли барча фосфолипаза активлиги ва яна учта минор компонентлар тўпланган бўлади. Бу жараёндаги фермент – лиганд комплекснинг бузилиши элюциянинг энг дастлабки босқичларида содир бўлади, бу эса фермент ва лигандлар орасидаги гидрофоб боғланишларнинг кучсизлиги ҳақида далолат беради. Бу кобра заҳаридаги фосфолипаза А₂ нинг боғланувчи қисмининг паст гидрофоблиги билан тушунтирилади. Ўрта Осиё кобраси заҳаридаги фосфолипаза А₂ нинг турли кўринишларининг мавжудлиги бошқа муаллифлар томонидан ҳам кўрсатилган.
7-расм ва 7-жадвалда чўл қора илони заҳаридан олинган фосфолипаза А₂ ни биоспецифик тозалаш учун синтезланган адсорбентни қўллаш натижалари келтирилган. Адсорбция ва десорбция жараёнлари худди кобра заҳаридан олинган фермент учун бўлган шароитларда олиб борилади. Бундан кўринадики, чўл қора илони заҳаридан олинган фосфолипаза А₂ адсорбент билан тўлиқ боғланади, 70 % оқсиллар колонка бўйлаб ўтади ва ферментатив фаолликка эга бўлмайди. Элюция жараёнида боғланган фосфолипаза А₂ адсорбент билан ўхшашлик босқичларида фарқланувчи 7 хил кўринишга бўлинади. Биринчи тўрт хил форманинг солиштирма фаоллиги қиёсий жиҳатдан юқори эмас, уларнинг ҳиссасига умумий фермент активлигининг 20 % и тўғри келади. Фосфолипаза фаоллигининг асосий қисми фосфатидилэтаноламин ёғ кислоталари қолдиқлари билан гидрофоб боғланишларининг юқори босқичлари билан фарқланувчи ферментнинг охирги уч хил кўринишига тўғри келади.

7-расм. Чўчқа ошқозоности бези (а), Ўрта Осиё кобраси (б), чўл қора илони (в) ва катта ковоғари (г) заҳаридаги фосфолипаза А₂ нинг биоспецифик адсорбцион хромотографияси. А_уд – солиштирма активлик, бирлик/мл; n– оқсил, мгр/мл; Т – тритон Х–100 концентрацияси, %; V–фракция ҳажми, мл. Тритон Х–100 концентрация градиенти бўйича элюция бошланиши стрелка билан кўрсатилган. 1–оқсил, 2–фаоллик, 3–элюирланувчи эритманинг концентрация градиенти.

8-расм. 7-расмдаги шароитларда ошқозоности безидан олинган фосфолипаза А₂ учун биоспецифик сорбент билан элюирланувчи 0–50 фракциялар сефадексидаги гель–фильтрация. А_уд – солиштирма активлик, бирлик/мл. D₂₈₀ – 280 нм даги оптик зичлик. Ўйиш – 15 % ли полиакриламид гелидаги электрофоретик тасвир.

Бошқа манбалардан олинган фосфолипазалар электрофоретик гомоген ҳисобланади: фосфолипазали фаолликка эга асосий фракциялар билан бир қаторда минор компонентлар ҳам иштирок этади. Диск – электрофорез натижалари бўйича, тозалашнинг юқори босқичи бир неча объектлардан (пахта уруғи, карам барглари, турп илдизи) ва каламуш жигари митохондриал фракцияларидан олинган фосфолипаза А₂ нинг турли формаларини тозалаш ушбу сорбентда эришилади.

Уларнинг ҳиссасига умумий заҳардаги дастлабки оқсилнинг 12 % и ва 80 % фаоллик билан боғланган қисми тўғри келади. Хромотографияда фермент фаоллигининг йўқотилиши деярли содир бўлмайди. Катта сонли элюцион юқори нуқталарнинг мавжудлиги кобра заҳари таркибидаги иммобилланган лигандга бир хил бўлмаган ўхшашликка эга турли фосфолипаза А₂ нинг кўринишлари ёки сорбентнинг сиртида турли аффинлик марказлари (фосфатидилэтаноламин ва этаноламин) мавжудлиги билан боғланган бўлиши мумкин. Ажралишнинг классик методлари (гель – фильтрация, ион алмашинувчи хромотография ва бошқалар) ни қўллаганда, ушбу объектдан фақатгина икки фосфолипаза А₂ ажратилади. Катта қовоғоари заҳаридан ажратилган фосфолипаза А₂ нинг аффин хромотографияси учун синтезланган адсорбентни қўллаш натижалари 7-расм ва 7-жадвалда кўрсатилган. Адсорбция ва десорбция шароитлари илонлар заҳридан ажратилган ферментлар билан анологик ҳисобланади. Аффин хромотографияси жараёнида заҳарнинг 90 % оқсили гидрофоб лиганд билан боғланмаган ҳолатда колонка бўйлаб ўтади. Бу жараёнда унинг иммобилланган фосфатидилэтаноламин билан гидрофоб боғланиш босқичлари билан фарқланувчи ики фракцияга аниқ кўринишда ажралади. Тритон Х–100 концентрация градиенти остидаги элюцияда фосфолипаза А₂ колонкадан элюциянинг энг охирги босқичларида десорбцияланади. Бу эса қовоғари заҳаридан олинган фосфолипаза А₂ илонлар заҳаридан олинган фосфолипаза А₂ солиштирганда, унинг боғланган участкасининг юқори гидрофоб хусусиятлари ҳақида гувоҳлик беради. Элюциянинг эгри чизиқларидан кўриниб турибдики, биоспецефик хромотография натижасида фосфолипаза А₂ фосфатидилэтаноламиннинг ёғ кислота қолдиқлари билан ўхшашлик даражалари бўйича фарқланувчи уч кўринишга бўлинади.

Шундай қилиб, қатор объектлар учун синтезланган сорбентни қўллаб ва фосфолипаза А₂ нинг сорбция ва десорбция шароитларини танлаган ҳолатда турли кшринишдаги ферментларни ажратиш ва тозалашни амалга ошириш мумкин. Бунда, табиийки, турли объектлар учун ферментни тозалаш даражалари ҳам турличадир. Ошқозоности бези фосфолипаза А₂ ҳолида олинган фермент етарли даражада гомоген: у гель – хромотографияда 0 –50 сефадекс орқали 1 нуқтада элюирланади (8-расм) ва 15 % ли полиакриламид гелидаги диск – электрофорезда бир чизиқни беради.