Аффин хромотографияси

БИОСПЕЦИФИК ХРОМОТОГРАФИЯСИ

Протеиназалар ингибиторлари ва қисман трипсин ингибитори (ТИ) табиатда кенг тарқалган ва ҳайвон, ўсимлик ва микроб кўринишидаги объектларда учрайди. Улар илмий тадқиқотларда ва тиббиётда оқсил алмашинувининг бузилиши билан боғлиқ касалликларни даволашда қўлланилади. Ҳозирги кунда ТИ га бўлган талаб жуда кучсиз ва асосан импорт қилинувчи ҳайвонлардан олинган препарат ҳисобига етказилади. ТИ нинг базасини ўсимлик объектлари ҳисобига етарли даражада кенгайтириш мумкин. Уларнинг ичида истиқболлилардан бири ТИ тутувчи беда ҳисобланади. Бу ингибитор бедадан ажратилган ва ажратишнинг классик методлари, шунингдек, трипсин – сефарозадаги аффин хромотографиясини қўллаш билан тозаланиши мумкин. Ушбу объектга бўлган қизиқиш шундан иборатки, ТИ ни ажратишни беданинг яшил массасидан протеинли концентратларни ишлаб чиқариш технологиясида ҳосил бўлувчи чиқиндилардан (жигарранг сок) ажратиш мумкин. Жигарранг сок таркибида ТИ нинг миқдори 20–50 мг/л ни ташкил этади.

Ушбу ишда беданинг жигарранг сокидан биоспецифик хромотография методи асосида ТИ ни ажратиш учун сорбент синтези шароитларини ишлаб чиқиш натижалари кўрсатилган. Лиганд сифатида трипсин препаратидан фойдаланилган, матрицалар сифатида тўқимачилик саноати чиқиндиларидан олинган полиамиднинг турли кўринишларидан фойдаланилган.

ТАЖРИБА ШАРОИТЛАРИ

ТИ нинг манбааси сифатида шоналаш давридаги бедадан (йўнгичка) фойдаланишган. Жигарранг шарбати беданинг электрик майдалагичда майдаланиши йўли билан олинган, яшил шарбатдан ажратиш узумли босимда, иссиқлик қайта ишлаш 82⁰ да 10 мин давомида ва коагуляцияланган қисмнинг йўқотилиши центрифугалаш (6000 g, 10 мин) усулида олиб борилади.

Эритмалардаги ТИ нинг таркиби синтетик субстрат – бензоил – аргинин – п – нитроанилин гидролизидаги трипсин фаоллиги катталигининг пасайиши бўйича аниқланади. ТИ нинг фаоллиги 1 мг оқсил препаратини ингибирловчи трипсин миқдорида (мг) кўрсатилади; трипсин фаоллиги -
1 мг оқсил ҳисобида 1 минутда гидролизланувчи субстратнинг мкмолларида.
Эритмалардаги оқсилнинг аниқланиши Лоури методи бўйича ва спектрофотометрик усулда λ 280 нм ютилишда олиб борилади.
Биоспецифик ТИ сорбент, бифункционал боғланишлар - госсипол ёки глутар альдегиди билан ўзгартирилган полиамидли ташувчига трипсинни ковалент боғлаш йўли билан синтезланади. Ташувчи сифатида П – 6 маркадаги полиамиднинг турли формалари: 0.14, 0.25, 0.50 ва 1.00 мм ли ўлчамдаги тирқишли чит орқали ажратиш йўли билан олинган кукунсимон, гранулаланган (2х2 мм), 0.1 ва 1.0 мм ли қалинликдаги тола ва капрон тўқимали турлари қўлланилади.
Кукунсимон полиамид тўқимачилик саноатининг чиқиндиларидан (капроннинг кичик парчаларидан) 1 кг тўқимага 2.5 л ҳисобидаги концентрланган сульфат кислотада (d=1.17) эритиш, ацетоннинг сувли эритмаларининг (0-50%) олти ҳажмини 1л/соат тезликда ўзгармас аралаштириб туриш йўли билан, полиамид чўкмасини Бюхнер воронкасидаги фильтрацияси ва декантацияси орқали алоҳидалаш, ҳавода қуритиш ва чит орқали ўтказиш билан олинади.
Ташувчининг фаоллантирилиши 2.5 – 4.2 М ли сульфат кислота эритмасида 45⁰ да 2 соат давомидаги ташувчи формасига боғлиқ равишдаги инкубация йўли билан олиб борилади. Ташувчи массасининг инкубацион эритма ҳажмига нисбати сорбент синтезининг барча амалларида гранулаланган учун – 1:2, кукунсимон учун – 1:7, толали ва тўқимали полимаид учун – 1:14 ни ташкил этди. Сульфат кислотанинг қолдиғини фаолланган ташувчини ацетон сувли эритмасининг (40 %) 2 ҳажми билан, сўнг эса нейтрал реакциягача сув билан ювиш орқали йўқотилади. Баъзи ҳолларда фаолланишдан сўнг сульфат кислотада полиамидга қайтарувчилар (литий-алюминий гидрид, натрийборгидрид) иштирокида органик эритувчилар (диэтил эфир, н – бутил спирт) муҳитида, 40 – 160⁰ С да қайта ишлов берилади. Бифункционал бирикмалар орқали ўзгартириш, фаолланган полиамидни 1 – 30 мг госсипол ёки 1 г ташувчидаги 0.5 мл 25 % ли глутар деальдегидининг сувли эритмасини тутувчи 0.1 М борат буфери, рН 9.0 да 24 соат давомида 20⁰ С да тинимсиз аралаштириб туриш орқали инкубация йўли билан амалга оширилади. Бифункционал агентнинг қолдиғи ташувчини сув билан ювиш орқали, госсиполдан фойдаланганда эса – этил спиртининг сувли эритмаси билан ювилган эритма тўла рансизлангунича ювилади.
Трипсиннинг ковалент боғланиши ўзгартирилган полиамидни 1 г ташувчида 10 – 200 мг трипсин препаратини (Spota, ЧССР) тутувчи 0.1 М борат буфери, рН 9.0 да инкубация йўли билан амалга оширилади. Инкубация жараёни 5 – 24 соат давомида тинимсиз аралаштириш билан олиб борилади. Боғланмаган трипсинни 1 М ли натрий хлорид эритмасининг 5 ҳажми билан, сўнг оқсилнинг йўқолгунича сув билан сорбентни ювиш орқали йўқотилади. Сорбент ҳавода қуритилади ва 4⁰ да сақланади. Полиамид турли формаларининг ўтказувчанлик хусусияти 10 г ташувчи билан табиий гидростатик босимда колонка (2х40 см) бўйлаб ўтаётган сув токи тезлигини ўлчаш ёрдамида аниқланади.
Ташувчи фаолланишининг оптимал шароитлари лиганд қолдиғини тутувчи (150 мг) 0.1 М борат буферида рН 9.0 да 1 г ўзгартирилган госсипол (30 мг) ташувчини инкубациясида ковалент боғланган трипсин миқдорини аниқлаш йўли билан баҳоланади.
Биоспецифик сорбентдаги ТИ адсорбциясининг оптимал шароитлари статик шароитларда 40 мл жигарранг шарбатда 4⁰ да турли вариантларда тинимсиз аралаштириш орқали 1 г кукунсимон сорбентни инкубация йўли билан аниқланади.
Носпецифик боғланган моддаларни сорбентдан ажратиб ташлаш ва ТИ элюцияси шартлари колонка режимида (0.8х10 см) эритмалар оқимининг мос равишдаги 100 ва 25 мл/соат тезлигида аниқланади.