Аффин хромотографияси

5.2 Тадқиқот натижаларининг таҳлили

ТИ нинг биоспецифик адсорбцион хромотография методини ишлаб чиқиш ўз ичига эримайдиган ташувчиларни оптимал формаларни, унинг активацияси ва модификацияси шароитларини, лиганднинг ковалент боғланишини, синтезланган сорбентдаги ТИ нинг сорбция ва десорбциясини аниқлашни олади.

Полиамидли ташувчининг олиниши. Полиамиднинг ташувчи сифатидаги қўлланилиши асосан турли кўринишлардаги (гранулалар, тўқима, тола) сорбентни олишнинг имкониятлари мавжудлиги билан асосланади.
Кукунсимон полиамиднинг турли фракцияларини тўқимачилик саноати чиқиндиларидан сульфат кислотада эритиш ва уни ацетоннинг турли концентрациядаги сувли эритмаларини қўшиш орқали чўктириш йўли билан олинади (8-жадвал).
8-жадвал маълумотларидан кўриниб турибдики, чўкмага тушаётган эритмадаги ацетоннинг концентрациясини ўзгартириш билан комплекс ҳосил бўлиш жараёнини тузатиш ва кукунсимон полиамиднинг аниқ фракцияларини чиқишини бошқариш мумкин. Полиамидли ташувчиларнинг кўринишлари – гранулалар, тола, майдаланган ёки майдаланмаган капрон тўқимаси колонка бўйлаб эритмалар ток тезлигига деярли таъсир кўрсатмади.
8-жадвал
Чўкмага тушаётган эритмадаги ацетон концентрациясига боғлиқ кукунсимон полиамид фракцион таркиби

Фракциялар ўлчами	Ацетоннинг сувли эритмасидаги концентрацияда фракцияларнинг таркиби, %					Колонка режимида ўтказиш хусусияти, мл/соат
	0	25	30	40	50
1.00 дан кўпроқ	18.0	16.6	0.4	0.1	0.0	240-250
0.50-1.00	18.3	17.3	13.8	4.2	15.8	150-160
0.25-0.50	23.5	24.1	68.4	29.7	10.6	120-130
0.14-0.25	26.7	25.0	14.2	55.0	58.1	75-100
0.14 дан камроқ	13.5	17.0	3.2	11.0	15.5	10-20

Полиамидли ташувчининг фаоллашуви. Ҳозирги кунда лигандларнинг ковалент боғланиши учун полиамидли ташувчиларнинг фаолланиши уларни сульфат кислота ёки диметилсульфоксид (ДМСО) эритмасида ишлов бериш, амид гуруҳларини қайта тиклаш орқали амалга оширилади. Боғланувчи лиганднинг миқдори ва ташувчи формаларнинг сақланиши фаолланиш методининг танлов мезони бўлиб хизмат қилади.
Полиамидли ташувчилар турли формаларни функционал гуруҳларни фаоллашган ҳолатга ўтказиш учун оптимал шароитларни аниқлаш ўтказилади (II расм).
Кўриниб турибдики, кукунсимон полиамид учун тритиннинг максимал миқдори (1 гр ташувчида 80 мг) фаолланиш жараёнида 3,8 М ли сульфат кислота эритмасида боғланади. Полиамид тўқима ҳолида сульфат кислотанинг оптимал концентрацияси 3,6 М ни ташкил этади, юқорироқ концентрациялар эса боғланувчи лиганднинг миқдорини оширсада, ташувчи структураларнинг бузилишга олиб келади. Гранулаланган полиамид фаолланишнинг оптимал шароитларида (4,18 М) 1 гр ташувчидаги 10 мг трипсингача боғланади, бу полисахарид ташувчи ҳажмидаги лиганд билан қиёсланади.
Биоспецифик сорбент синтезининг оптимал шароитларини баҳолашнинг муҳим мезонларидан бири носпецифик сорбциянинг қиймати ҳисобланади. Полиамидли сорбентнинг сирти билан носпецифик боғланиш асосан, сульфат кислотадаги ташувчининг фаолланишда ҳосил бўладиган эркин корбоксил гуруҳларининг мавжудлиги билан тушунтирилиши мумкин. Шу сабаб сорбент синтези бўйича тадқиқотлар органик эритувчилар глутар диальдегидининг босқичли ўзгартирилиши муҳитида ташувчи амидли гуруҳларнинг литиалюминий ёки натрийборгидрид ёрдамидаги қайтарилиш йўли билан аниқланади.
Ўзгартиришнинг бу усули оқсилларнинг носпецифик сорбциясига муҳим таъсир кўрсатмаслиги ва боғланувчи лиганднинг миқдорини 20–25 % га ошириш имкониятининг берилиши аниқланган. Бунга анологик равишдаги натижалар сульфат кислотадаги активлаштирилган полиамидни диэтил эфир муҳитида литийалюминийгидрид билан қайта ишлаб қайтарилиши натижасида олинган.
Лиганднинг ковалент боғланиши. Функционал аминогуруҳларни тутувчи активланган полиамид трипсинни ковалент боғлаш шароитларини таъминлаш учун бифункционал боғланиш – госсипол ёки глутар диальдегиди орқали ўзгартирилади. Полиамидли ташувчини ўзгартириш учун зарур глутар диальдегидининг оптимал концентрацияси ушбу ишда маълум.
12-расмда (1, 2 – эгри чизиқлар) боғланувчи трипсил миқдорига госсипол концентрациясининг таъсирини ўрганиш бўйича тадқиқотлар натижалари келтирилган. Кўриниб турибдики, оралиқ реагент концентрациясининг ортиши боғланувчи оқсил лиганднинг миқдорининг ортиши (1 гр ташувчида 20 –25 мг госсипол концентрациясида кукунсимон полиамид учун (12-расмга қаранг, 1-эгри чизиқ) шунингдек, толали (12–расмга қаранг, 2-эгри чизиқ) максимал қийматларга етказган ҳолда) билан боради.
Маълумки, лиганднинг биоспецифик комплексларни ҳосил қилиш қобилияти қисман матрица билан ковалент боғлангандан кейинги биологик фаоллигининг сақланиши билан аниқланади.

11-расм. Иммобилланган трипсин миқдорининг кукунсимон (1), толали (2) ва гранулали (3) полиамид формалари учун фаолланишидаги сульфат кислота концентрациясига боғлиқлиги – 1 гр ташувчидаги мг оқсилда боғланган лиганд (трипсин) миқдори. Юлдузча билан ташувчи формалари деструкциясининг бошланиши кўрсатилган.

12-расм. Иммобилланган трипсин миқдори ва унинг фаоллигининг модификация пайтидаги госсипол концентрациясига боғлиқлиги:

1,2 – трипсиннинг боғланиши, мос равишда 1 г кукунсимон ва тўқимали полиамидларда мг оқсил; 3,4 – мос равишда 1 г сорбент ёки 1 мл боғланган оқсил ҳисобидаги кукунсимон полиамидда иммобилланган трипсиннинг нисбий фаоллиги; А - иммобилланган трипсиннинг фаоллиги; А_М – унинг максимал фаоллиги. L – 11-расмдаги ёзув сингари.

Шу муносабат билан иммобилланган трипсиннинг каталитик фаоллигини унинг сорбентдаги концентрациясига боғлиқ равишда ўрганиш бўйича тадқиқотлар олиб борилади. Боғланган трипсин миқдорининг ошиши билан унинг 1 гр сорбент ҳисобидаги активланишининг ўсиши кузатилади (12-расмга қаранг, 3-эгри чизиқ). Айни шу вақтда лиганднинг сорбентдаги миқдорининг ортиши 1 мг иммобилланган оқсил ҳисобидаги фермент солиштирма активлигининг пасайиши билан бўлади (12-расмга қаранг, 4-эгри чизиқ), бу фақатгина оқсил – ташувчи макромолекулалариаро алоқаларнинг пайдо бўлиши билан эмас, балки актив бўлмаган тўртламчи структураларнинг ҳосил бўлиши билан молекуляр боғланиш ҳисобига ташувчи сиртида оқсил молекулаларининг ассоциацияси билан таърифланади. Ташувчи формасига боғлиқ иммобилланган трипсиннинг активлиги 47.17 ва 27 % кукунсимон, тўқимали ва толали сорбентлар учун мос равишда натив фермент фаоллигига боғлиқ бўлади.

Лиганднинг турли кўринишдаги ташувчилар билан боғланиш кинетикасини ўрганиш шуни кўрсатадики, кукунсимон ташувчилар учун трипсин эритмасидаги полиамиднинг инкубациясининг оптимал вақти 5–6, толалилар учун эса – 20–24 соатни ташкил этади (13-расм).

13-расм. 14 – расм.

13-расм. Трипсиннинг кукунсимон (1) ва толали (2) полиамид ташувчилари билан ковалент боғланишининг кинетикаси:

L_M –боғланган лиганднинг максимал миқдори; T – инкубация вақти, L – 11-расмнинг остки ёзуви сифатида.

14 – расм. Инкубацион муҳитдаги 1 г сорбент ҳисобидаги боғланган лиганд миқдорига трипсин концентрациясининг таъсири.

Лиганднинг самарали боғланиши учун дастлабки инкубацион муҳитдаги трипсин: полиамид нисбати катта аҳамиятга эга. 14-расм маълумотларидан кўриниб турибдики, полиамиднинг ўзгармас таркибли муҳитида трипсин концентрациясининг ошиши мос равишдаги ковалент боғланган оқсил миқдорининг ортишига олиб келади.

Маълум бўлишича, биоспецифик сорбент синтезининг охирги босқичи лиганд бирикишидан сўнг эркин ҳолатда қолган фаол функционал гуруҳларнинг тўхтатилиши ҳисобланади. Биргина, моноэтаноламин ёрдамидаги синтезланган сорбентлар эркин альдегид гуруҳларнинг тўхталишига доир тажрибалар шуни кўрсатадики, бунда иммобилланган трипсин фаоллиги сезиларли даражада (50–70 % га) пасайади. Бундан ташқари, моноэтаноламин орқали блокировка қилиш сорбентни қайта ишлашнинг бу босқичи мақсадга йўналтирилмаган деб топилганлиги учун, носпецифик сорбцияга мусбат таъсир кўрсатмайди. Оптимал шароитларда аниқланган турли кўринишлардаги полиамид ташувчилар асосида синтезланган сорбентларнинг хусусиятлари 9-жадвалда келтирилган.
ТИ нинг биоспецифик сорбентдаги сорбцияси. Иммобилланган лиганд билан биополимерларнинг комплекс ҳосил қилувчанлик шартларининг ўрганилиши сорбциянинг оптимал шароитлари ҳақидаги ахборотларни олиш ва бу комплексларнинг ҳосил бўлишини асослаб берувчи кучларнинг кимёвий табиатини таърифлаш имкониятини беради.