Академии наук т. П. Побежимова, А. В. Колесниченко, О. И. Грабельных
Download 1.37 Mb. Pdf ko'rish
|
pobezhimova полярография
|
3.1
Иммуноэлектрофорез в агарозе. Электрофорез белков проводят по Грабар и Уильямс (Остерман, 1983). На горизонтально расположенное предметное стекло наливают 5 мл расплавленного 1%-ного раствора агарозы, приготовленной на 0.025 М ацетат-барбиталовом буфере с рН 8.9, так, чтобы образовался слой геля толщиной 1.5 мм. Белковый препарат в объеме 50 мкл наносят в одну или две цилиндрические 78 лунки, изготовленные с помощью штампа-пробойника и расположенные на расстоянии 1.5 см от катодного края стекла, а также с помощью штампа прорезают продольные стенки канавок для антисыворотки, имеющих ширину 2 мм. Предметные стекла со слоем геля на них помещают на горизонтально расположенный столик прибора для электрофореза в агарозе и припаивают расплавом 1%-ного раствора агарозы к агарозным столбикам, находящимся в катодном и анодном отсеках прибора для электрофореза. В качестве электродного также используется 0.025 М ацетат-барбиталовый буфер с pH 8.9. Электрофорез проводится в течении двух часов при напряжении 6 - 8 V/см в холодной комнате при температуре 4 0 С. Момент окончания электрофореза определяют по времени достижения лидирующим красителем (бромфеноловый синий) края предметного стекла. После окончания электрофореза из канавок для антисыворотки извлекают агарозу и в них до уровня геля заливают разбавленную проявляющую антисыворотку. Диффузия разделенного электрофорезом белка и проявляющей антисыворотки и образование преципитата проводят в чашках Петри в холодильнике в течение трех суток. Затем в течение трех- четырех суток проводят отмывку препаратов 0.15 М водным раствором NaCl для удаления непрореагировавших антигенов и антител. Препараты высушивают и окрашивают 0.1% раствором амидового черного в 7% уксусной кислоте. Отмывка препаратов производится 7% уксусной кислотой до обесцвечивания фона. Этот метод позволяет определить количество антигенов в белковой смеси и их относительную электрофоретическую подвижность, а также наличие или отсутствие в белковом препарате определенных антигенов (Рис. 19). 79 Рис. 19. Иммуноэлектрофорез в агарозе по Грабар и Уильямс. Стрелками показаны линии преципитации индивидуальных белков. Download 1.37 Mb. Do'stlaringiz bilan baham: 
|