Iii. Veterinariya qonunchiligida temiratki kasalligiga qarshi kurashish bo’yicha yo’riqnomalar

2.3. Bakteriologik tekshirishda patologik namunalarga ishlov berish.
Siydik 10 – 15 ming oboratda 30 minut sentrafugalanadi. Yuza va cho’kmasi alohida tekshiriladi. Qonni plazma qismi tekshiriladi. Organlardan fiziologik eritma bilan suspenziya tayyorlanib tekshiriladi.
Bakterioskopiya. Leptospirozni tekshirishda “ezilgan tomchi” usulida preparat tayyorlanib mikroskopning yarim qorag’uligida tekshiriladi. Leptosipalar burama shaklli, uzunligi 5 – 20 mkm, eni 0,1 – 0,2 mkm. Tanasining ikki cheti ilgakdek bukilgan yoki yo’g’onlashgan. Mikrob harakatchan, lekin xivchinlari yo’q. Fibrinlari bilan harakat qiladi. Leptospiralar Gr - , Romonovskiy – Gimza usulida binafsha rangga 48 – soatda bo’yaladi. Lyuminessentli mikroskopda
tekshirish uchun surtma preparat tayyorlanib maxsus fluoressensiyalovchi globulin bilan bo’yaladi. Mikroskopda leptospiralarning aniqlanilishi kasallikka diagnoz qo’yishga asos bo’ladi va boshqa tekshirishlar o’tkazilmaydi.
2.4. Leptospiralarni sof kulturani ajratish usullari Leptospiralarning sof kulturasini ajratish uchun tekshiriladigan materiallarda mikroblarning bir turi emas balki bir necha turi bo’lishi mumkin. Bu turdagi mikroorganizmlardan bir turini qo’yidagi usullarda ajratiladi. Suyultirish, yoyish va tarqatish, elektiv oziqa muhitlarida o’stirish, basillalarni ajtatish, biologik tozalash, immun zardoblar orqali aniqlash usullari qo’llaniladi.
Suyultirish usulida tekshiriladigan materiallar sterillangan suyuq oziq muhitlarida yoki fiziologik eritmalarda suyultiriladi. Suyultirishda materialning turiga va mikroorganizmlarning soniga bog’liq. 1:100, 1: 1000, 1 : 10000 nisbatda suyultirilganda mikroorganizmlarning soni kamayadi. Shunday qilib patologik materialda leptospiralar qancha ko’p miqdarda suyultirilsa mikroorganizmlar soni kamayadi. Eng oxirgi suyultirilgan namunadan oziqa muhitlariga ekiladi va unda lptospiralarning o’sishi yaxshi bo’ladi. Shunday qilib keraklicha suyultirilagnda mikroblar kulturasi olib tekshiriladi. Bakteriologik kosachaga 1 – 2 tomchi suyultirilgan namuna solinadi va shpatel bilan sekin yoyiladi keyin ikkinchi kosachaga va uchinchi kosachaga birinchisiga nisbatan ikkinchisida, ikkinchisiga
nisbatan uchinchisida mikroorganizmlar sani kamayadi. O’sgan mikrob kulturasidan leptospiralarga xos xususiyatlarni boshqa muhitlarga ekiladi.
Yoyish yoki tarqatish usulida bakteriologik kosachadagi zich oziq muhitning yuza qismiga tekshiriladigan namunaning bir qismi bakteriologik kosachaga tamiziladi. Agar quyuq bo’lsa fiziologik eritma bilan suyultirib zich oziq muhitlariga ekiladi. Tomizilgan tomchini shpatel bilan yoyiladi va birinchi kosachadan ikkinchisiga ikkinchisidan uchunchisiga o’tkaziladi uchinchi bakteriologik kosachadagi mikroorganizmlar birinchisiga nisbatan soni kamroq bo’ladi. Leptospiralarni siyraklashtirgandan keyin termostatga qo’yiladi. O’sib chiqqan leptospiralarni koloniyalari urganiladi. Chunki bir mikrob xujayrasidan hosil bo’lgan koloniyada bir xil mikroorganizmlar bo’ladi.
Elektiv, yani maxsus oziqa muhitlari yordamida leptospiralarni sof kulturasini ajratib olish uchun maxsus moddalar sharoit talab qiladi. Boshqa mikroorganizm turlariga bu moddalar va sharoit o’sishi uchun to’sqinlik qiladi. Shuning uchun leptospiralarni ustirishda alohida oziqa muhitlari talab qilinadi hamda tayyorlanadi.
Bunday oziqa muhitlariga leptospira qo’zg’atuvchilari ekilganda boshqa mikroorganizmlar o’smaydi leptospiroz qo’zg’atuvchilari usadi. Maxsus tayyorlangan oziqa muhitlardagi sharoit boshqa mikroorganizmlarni usishi uchun to’sqinliq qiladi. Usib chiqqan mikrob kulturalaridan surtma preparatlar tayyorlanadi va leptospiralarning xususiyatlariurganiladi.
Biologik tozalash usulida tekshiriladigan materialni 70 – 80 0 S da 10 – 15 daqiqa isitib sovitiladi va sterillangan fizioologik eritma bilan emulsiya holiga keltiriladi. Keyin emulsiya bilan laboratoriya hayvonlariga zararlantiriladi. Hayvon
o’lgandan keyin qonidan ichki organlaridan material olinib tekshiriladi.
Tekshiriladigan materialda leptospiralarni sof kulturasini ajratish mumkin. 2.5. Leptospiralarning kultural xususiyatlarini aniqlash.
Laboratoriya ajratilgan har – bir mikrob kulturasi albatta identifikasiya qilinadi, yani uning turlari aniqlaniladi. Buning uchun qo’yidagi xususiyatlari urganiladi. Morfologiyasida xujayraning shakli o’zaro joylashishi, hajmi, spora va kapsula hosil qilishi va harakatlari. Bulardan tashqari tinktorial, kultural, bioximiyaviy, toksigenligi, patogenligi, antigenlik xususiyatlari ham urganiladi.
Mikroorganizmlarni identifikasiya qilishda asosan 24 – 48 soatda usgan kulturalar ishlatiladi. Chunki eski mikroorganizmlarda xususiyatlari o’zgarishi mumkin.
Leptospiralar zich oziq muhitlarda o’ziga xos koloniyalar hosil qilib o’sadi.
Koloniya deb bir tur o’sib chiqqan mikroorganizmlar to’plamiga aytiladi. Har bir koloniyalarda yuz mingdan ikki millyardgacha mikrob xujayralari bo’lishi mumkin. Zich oziqa muhitlarida o’sish o’rtacha bo’ladi. Hajmi 2 mm gacha bo’ladi, bu mayda koloniyalar deyiladi. Shakli yumoloq, amyobasimon. Yuzasi silliq burtib chiqqan, relfi tekist, chetlari g’adir – budir, tiniqligi tiniq, yaltiroq.
Rangi pegment hosil qilib o’sadi. Suyuq oziqa mihitda, muhitning yuzasida xalqa, parda hosil qiladi. Loyqalanish o’rta darajada bo’ladi. Suyuq oziqa muhitida leptospiralar loyqalanish kuchli darajada bo’ladi. rangi biroz o’zgaradi.
Leptospiralar oddiy oziq muhitlarda o’smaydi. Namunadan maxsus oziq muhitlarga ekiladi. Yarim so’yuq yoki so’yuq oziq muhitlarga Paster pipetkasi bilan 3 – 5 tomchidan 5 – 6 probirkaga ekiladi. Ko’pincha Lyuboshenko va Ulengut tavsiya etgan muhitlar qo’llaniladi.
Lyuboshenko muhiti: daryo yoki quduq suvi qog’oz filtrdan o’tkaziladi.
Avtoklavda 1 atm. 30 minut sterillanadi va qizdirilgan quyonning yoki qo’chqorning qon zardobidan 5% qo’shiladi, 56 º S – da 1 soat saqlanadi. Keyin Zeyts filtridan o’tkazilib boksda probirkalarga qo’yiladi. Muhitning sterilligi probirkalarni termostatda 37º S – da 48 soat saqlanib aniqlaniladi.
Ulengut muhiti: vodoprovod suvi bo’g’ oqimida sterillanadi. Suvning 10 qismiga 1 qism otning yoki quyonning qon zardobidan qo’shiladi va probirkalarga 3 ml qo’yiladi, ustidan 1 ml suyuq parafin qo’yiladi.
Leptospiralar fakultativ anaeroblar 29 - 30º S da 3 oy moboynida rivojlanadi. 3. 5. 7.10 –chi kunlari keyin har 5 kunda probirkalardan “ezilgan tomchi” preparatlari tayyorlanib tekshiriladi. Odatda 3 – 5 kunlari o’sish boshlanadi.
O’sgan probirkalardan 0,5 ml olinib yangi oziq muhitlarga ekilganda 4 – 7 kunda shiddatli o’sish ko’rinadi. Patologik materialdan oziqa muhitlariga ekilib leptospiralarni har doim ajratib bo’lmaydi. Shu sababli amaliyotda ko’pincha biologik sinov qo’llaniladi.
Biologik sinov: 10 – 20 kunlik quyon bolasida yoki 3 – 5 haftali dengiz cho’chqasida hamda 20 – 30 kunlik tilla rangli olmaxonlarda o’tkaziladi. Qon, siydik, parenximatoz organlardan tayyorlangan suspenziya olmaxonga 0,5 – 1,0 ml, qo’yonlarga 2 – 3 ml, dengiz cho’chqalariga 1 – 2 ml zararlanadi. Tajribaga ikkitadan hayvon olinadi. Zararlangan hayvonlarning bittasini 4 – 5 chi kuni o’ldiriladi 2 – si agarda o’zi o’lmasa 14 – 16 kunlari o’ldiriladi va ularning qoni MAR – da tekshiriladi: qon zardobi 1 : 10 dan boshlanib suyultiriladi va 13 ta seroguruhga kiruvchi leptospiralardan tayyorlangan antigenlar bilan reaksiya qo’yiladi. MAR – ning musbat natijasi patologik materialda leptosperalar borligidan darak beradi. Agarda sof kultura ajratilgan bo’lsa uning patogenligini aniqlamoqchi bo’lsak, 5 – 7 kunlik kultura bilan (mikroskopning ko’rinishida 70 – 100 leptospiralar aniqlanib) olmaxonning qorin bo’shlig’iga zararlanadi. Agarda 0,1 ml kultura olmaxonni 5 – 12 kunda o’ldirsa, u yuqori virulentli hisoblanadi.
Ajratilgan sof kulturaning seroguruhlarini aniqlash uchun turli guruhdagi agglyutinlovchi zardoblarni 1: 50 – 1: 3000 marta suyultirilib MAR – si qo’yiladi.
Maxsus lunkali plastinkaga yoki probirkalarga 0,1 ml suyultirilgan zardoblardan qo’yib 0,1 ml 5 – 10 kun o’sgan kultura bilan aralashtiriladi. Keyin termostatda 37ºS da 1 soat saqlanadi va har – bir probirkadan “ezilgan tomchi” preparat tayyorlanib natija aniqlaniladi va krestlar bilan baholanadi. ++++ - 100%
agglyutinasiya, +++ - 75 % agglyutinasiya, ++ - 50 % agglyutinasiya, + - 25 % agglyutinasiya, - agglyutinasiya yo’q.
Agglyutinasiya holati leptospiralarning bir – biriga yopishishi va “o’rgamchak” shakllar hosil qilishi bilan belgilanadi. 4, 3 va 2 krest bilan baholangan MAR musbat hisoblanadi va tekshiriladigan kultura qaysi zardobning etiketkasidagi ko’rsatilgan titrining 50 – 100 % bilan musbat natija bersa, usha seroguruhga kiradi.
Sutni bakteriologik tekshirish. Bu bir necha usulda bajariladi. Ko’pincha qo’yidagi usul ishlatiladi: 500 ml sut namunasi 10 – 15 ming oborat minutda sentrafugalanadi. Cho’kmasidan 2 – 3 ml qo’yonning terisi ostiga yuborilib zararlanadi. (avval qo’yonning qoni MAR bilan leptospirozga tekshiriladi). 7, 14 va 20 kundan keyin qo’yonning qoni MAR da tekshiriladi. MAR – ning 1:10 va undan yuqori musbat reaksiyasi sutda patogen leptospiralar borligidan dalolat beradi.
Serologik diagnostika MAR va AR – larida qo’yiladi. Tekshirish uchun qon zardobi hayvon kasallangandan 5 – 7 kuni va ikkinchi marta 7 – 10 kunlarida olinadi. Antigen sifatida tirik leptospiralar ishlatiladi. Asosan veterinariya laboratoriyalarida MAR – ni 6 – ta seroguruhdagi leptospiralar bilan qo’yiladi. (Romana, Gruppotyphosa, Tarassovi, Icterohaemorrhagiae, Hebdomadis, Canicola). Tekshiriladigan zardob qo’yidagicha 1:10 – 1: 2500 gacha suyultiriladi.
Avval zardob fiziologik eritma bilan 1: 50, 1 : 250 va 1 : 1250 marta suyultiriladi va 0,1 ml dan maxsus plastinkaning lunkalariga yoki probirkalarga qo’yiladi. Har bir leptospira kulturasidan 0,1 ml 3 ta zardob suyultirilgan probirkalarga qo’shiladi. Natijada zardob 1 : 100, 1 : 500 va 1 : 2500 marta suyultiriladi.
Plastinkalar sekin siltanib, termostatga 30ºS – da 1 soat saqlanadi. Bir vaqtda kontrol reaksiya 0,1 ml kulturaga 0,1 ml fizioologik eritma qo’yiladi. Tajribaning natijasi namunalardan “ezilgan tomchi” preparatlarni tayyorlab mikroskopda tekshiriladi. 4, 3 va 2 krestlar zardobning barcha suyultirilganlarida bo’lsa musbat hisoblanadi.
AR buyum buyum shishasida qo’yiladi(tomchi usuli) 0,4 ml zardobni + tomchi antigen (barcha seroguruhlarning aralashmasi) natijasi 1 - sekundan 10 minutgacha aniqlanadi. Ranglanishiga ko’ra 4, 3 va 2 krest musbat, 1 krest manfiy reaksiyadir.
Hozirgi kunga qadar hayvonat olami va odamlarda 90 ga yaqin patogen leptospiralar ajratib olingan bo’lib, ular 13 – serologik guruhga mansubdir.
Leptospiralar morfologik jihatdan bir – biridan unchalik farq qilmasdan, yarim aylanma, spiral holatda, S, X, 8 shakllarida uchraydi. Bu guruhga har xil harakat qilishxos bo’lib, ayrimlari filtrlanuvchi xususiyatiga ham egadir. Leptospiralar termostatda 28 – 300 S da 5 – 20 kun ichida o’stirilib, bunda asosan Lyubashenko, Terskix, Fervort – Volfa, VGNKI, Kortgof, Fletcher muhitlaridan foydalaniladi.