Immunosorbentlar va ularni olish usullari

Amaliy mashg‘ulot №10 : POMIDOR VIRUSLARINI IMMUNOFERMENT ANALIZNING “SENDVICH” USULIDA ANIQLASH.

Ishni maqsadi: POMIDOR VIRUSLARINI IMMUNOFERMENT ANALIZINING “NIQOBLANISH” USULIDA ANIQLASH.

Ishni bajarish uchun namuna
Viruslarni IFA ning “Sendvich” usulida aniqlash polistirolga adsorbsiyalangan qarshi antitelalarning ketma ket virus va antitelalarning peroksidaza bilan konyugati bilan ta’sirlashishini o‘z ichiga oladi. Qattiq fazadagi ferment aktivligi virusning boshlang‘ich konsentratsiyasiga proporsionaldir va tekshirilayotgan namunadagi virus miqdorini xarakterlaydi.
Kerakli material va asboblar: Pomidor virusi va unga qarshi olingan antitela, spetsifik antitelalarning peroksidaza bilan kon’yugati, peroksidaza aktivligini aniqlashga 5-aminosalitsil kislota asosida substrat aralashmasi, polistrol planshetlari, avtomat-pipetkalar, spektrofotometr.
Usulining tavsifi
1.Antitelalaradsorbsiyasi:antitelalarningadsorbsion immunobilizayiyasiga antitelalarning fosfatbuferidagi 5 mkg/ml li konsentratsiyadgi eritmasi ishlatiladi. Planshet chuqurchasiga 0,2 ml eritma quyiladi. So‘ngra planshetlar qopqog‘i bilan berkitiladi va 40S da tun bo‘yi qoldiriladi. Eritmsiga planshet chuqurchalaridagi suyuqlik to‘kib tashlanadi va tvin-20 tutgan fosfat buferi (TFB) bilan yuviladi. Planshetlar havoda kiritilgandan so‘ng – 200S da bir necha oy mobaynida immunologik aktivligini yo‘qotmaydi.
2. Tekshirilayotgan namunalarni qo‘shish: Hamma tekshirilayotgan namunalar planshet chuqurchalariga 0,2 ml hajmdagi TFB /boshlang‘ich virus namunasi 10-50 marta suyultiriladi/ solinadi va 37 S da1 soatga qoldiriladi. Har bir aniqlanayotgan namuna uchun 2-3 parallel o‘lchash o‘tkaziladi. Kontrol sifatida virus bilan zararlangan sog‘ o‘simlik ekstraktlari olinadi.
3. So‘ngra antigen eritmasi to‘kib tashlanadi va 4 marta TFB bilan yuviladi. Konyugat TFB da 1 – 2,5 mkg/ml konsentratsiyagacha suyultiriladi va planshet chuqurchalariga 0,2 dan qo‘yiladi. Planshetlar 370 S da 1 soat davomida qoldiriladi va 4 marta TFB bilan yuviladi.
4. Keyin planshet chuqurchalariga 0,2 ml substrat aralashmasi qo‘shiladi va xona haroratida 30-40 minutga qoldiriladi. IFA natijalari ko‘z bilan yoki spektrofotometrda λ= 450 nm da o‘lchanadi.