Информационный материал по курсу вуза «Биотехнология»

Chuqur muzlashga tayyorgarlik usullari. Ma'lumki, hujayralarning muzlashga chidamliligi ularning boshlang'ich morfofunktsional holatiga bog'liq bo'lib, u kultivatsiya xususiyatlari, o'sish bosqichi va boshqalar bilan belgilanadi. Siz hujayralarni o'sishning logaritmik bosqichida muzlatib qo'yishingiz mumkin, keyin ular uchun optimal sovutish tezligini tanlash kerak, ba'zida kriyoprotektorlardan foydalanish kerak bo'ladi. Kriosaqlash ishlarini olib borishda, avvalo, o'simlik hujayralarining o'ziga xos xususiyatlarini hisobga olish, kichik vakuol va suv miqdori kamaygan kichik hujayralarni tanlash kerak.
Kriyoprezervatsiya jarayoniga fiziologik yondashuvlar xilma-xildir. Ulardan biri kriyokonservalashdan oldin etishtirish bosqichidir. Ba'zi hollarda organizmlarning krioga chidamliligi madaniy muhit tarkibiga bog'liq. Kultivatsiya muhitida uglerod va azot nisbatining o'zgarishi, unga yog ' kislotalari, kaltsiy tuzlari yoki boshqa tarkibiy qismlarning kiritilishi ushbu sharoitda etishtirilgan organizmlarning kriyosensitivligini o'zgartiradi. Shu munosabat bilan ma'lum sharoitlarda o'simlik hujayralarini oldindan etishtirish taklif qilindi.
Past haroratda hujayralarning qisqa inkubatsiyasi va sovuqqa chidamli hujayralarning tabiiy tayyorgarligi — qattiqlashuvning krioga chidamliligiga ijobiy ta'sir ko'rsatdi. Hujayra suspenziyalarining qattiqlashishi madaniyat haroratini asta-sekin pasaytirish va shu bilan birga muhitda saxaroza kontsentratsiyasini oshirish orqali amalga oshiriladi, so'ngra turli xil kriyoprotektorlar qo'shiladi. Biroq, qattiqlashish qobiliyati genetik jihatdan aniqlanadi.
Kriyoservatsiyaga tayyorgarlikning yana bir fiziologik yondashuvi osmotik faol moddalar — kriyoprotektorlarni qo'shish orqali muhitning suv potentsialini kamaytirishga asoslangan. Ma'lum kriyoprotektorlar orasida dimetil sulfoksid (DMSO, 5-10%), glitserin (10-20%) kabi hujayralarga osonlikcha kirib boradigan moddalar, shuningdek penetratsion bo'lmagan yuqori molekulyar og'irliklar — polivi-nilpirolidon (PVP), dekstran, polietilen glikol (PEG) ajralib turadi.molekulyar og'irligi 6000.
Saxaroza, tre-galoza va ushbu eritmalarning aralashmalari ham kriyoprotektorlar bo'lib xizmat qilishi mumkin. Bundan tashqari, mannitol va sorbitol bilan oldindan etishtirish (2-6% konsentratsiyada) hujayralar kengayishini kamaytirishga yordam berdi. Kriosaqlashga bunday tayyorgarlikning ijobiy ta'siri hujayralar suvliligining pasayishi bilan bog'liq.
Tayyorgarlikning keyingi usuli suv etishmasligidan kelib chiqadigan turli xil stresslarda ba'zi endogen aminokislotalarning fiziologik roli bilan bog'liq. Bu, birinchi navbatda, prolin bo'lib, uning o'simlik hujayralarida suvni bog'lash qiymati keng ma'lum. Ushbu maqsadlar uchun alanin, asparagin, seriya, glitsin, u-amino-butirik kislota ham qo'llaniladi.
Ma'lumki, past haroratga qarshilik ko'rsatadigan stressli oqsillarning shakllanishi aba fitohormoni tomonidan tartibga solinadi. Ekzogen aba ta'siri natijasida sovuqqa chidamliligini oshirish va o'simlik ob'ektlarida himoya mexanizmlarini shakllantirishga erishish mumkin, bu kriyoprezervatsiya maqsadlarida muhimdir.
Kriyomikroskop ostidagi hujayralarni kuzatayotganda, hujayra ichidagi muzning qanday paydo bo'lishi aniq ko'rinadi, bu gipotermiya darajasiga, muzlash tezligiga, hujayralarni o'rab turgan eritmaning kristallanish boshlanish markazlarining mavjudligiga yoki yo'qligiga bevosita bog'liq.
Kriosaqlashda to'g'ri tanlangan muzlatish rejimi katta ahamiyatga ega. Shunday qilib, hujayralar, o'simlik to'qimalari va mikroorganizmlarni kriosaqlashda, muzlatishning birinchi bosqichida 0,25-1,0 °C/min (-40 °C gacha) kristallanish boshlanishi va sovutish tezligi bilan dasturiy muzlatishni qo'llash tavsiya etiladi, ikkinchi bosqichda — tezlikni 9-10 °C /min ga oshiring va -60 °C ga yetganda, ularni tezda suvga botiring. suyuq azotga.
Ushbu ish dasturiy ta'minotni muzlatishni ta'minlaydigan maxsus uskunalarda amalga oshiriladi. Bunday qurilmalar kriobiologiya va kriomeditsina muammolari instituti (Xarkov shahri) qoshidagi tajriba ishlab chiqarish bilan maxsus konstruktorlik texnologik byurosi tomonidan ishlab chiqariladi.
Этап Kriyoprotektorlarni olib tashlash va melioratsiya bosqichi alohida ehtiyot choralarini talab qiladi, chunki omon qolgan hujayralar og'ir stressni boshdan kechirgan va qisman shikastlangan. Ularni saqlab qolish uchun hujayralar va plazmalemmaga qo'shimcha zarar etkazadigan barcha ta'sirlarni minimallashtirish kerak. Biroq, kriyoprotektorlarni olib tashlash kerak. Eritmaning yuzasida joylashgan filtrlarga hujayra suspenziyasini ekishdan so'ng hujayralardan suyuq muhitga kriyoprotektorlarning tarqalishiga asoslangan meliorativ jarayonni kuchaytirishning fiziologik, yumshoq usuli taklif qilindi. Bu qo'shimcha stressni oldini olish uchun hujayralarni bezovta qilmasdan eritmani o'zgartirishga imkon beradi va shu bilan melioratsiyani kuchaytiradi.
Eritishdan keyin hujayralarning hayotiyligini aniqlash uchun eng oddiy, tezkor va juda qoniqarli usul qo'llaniladi: hayotiy bo'yoq bilan bo'yash (0,1% fenosafranin eritmasi yoki 0,25% Evans ko'k eritmasi), unda o'lik hujayralar bo'yalgan, ammo tirik hujayralar yo'q. Hujayralarning hayotiyligining yakuniy mezoni, albatta, eriganidan keyin sun'iy oziqlantiruvchi muhitda melioratsiya paytida ularning o'sishi va bo'linishini aniq tiklashdir.
Shunday qilib, agar chuqur muzlash vaqtida hujayra shtammlari yangilanish qobiliyatini saqlab qolgan bo'lsa, unda kriosaqlashdan keyin ham bu o'simliklarni suyuq azotda saqlash muddatidan qat'i nazar, qayta tiklash mumkin, chunki yillar o'tib hujayra madaniyatining o'sishini tiklash mumkin va kriosaqlashda embriogen va morfogenetik kuchlar o'zgarmaydi. saqlash rejimi u buzilmagan, ya'ni harorat hech qachon -140 °C dan oshmagan va kriyokonservalashning barcha bosqichlari etarlicha optimallashtirilgan. Shuning uchun, kriyosozlanish aslida to'xtatilgan animatsiya (kriyobioz) holatida saqlanib qoladi, bu erda barcha hayotiy jarayonlar to'xtatiladi, ammo to'g'ri erishi va meliorativ holati bilan ularni qayta tiklash va biologik ob'ektlarni "jonlantirish" mumkin.
Shu bilan birga, kriosaqlashda hujayralarning omon qolishini ta'minlash uchun maqbul sharoitlarni tanlash bo'yicha keyingi tadqiqot ishlari talab qilinadi. Hujayralarning morfofiziologik va genetik xususiyatlarini, ularning qotib qolish qobiliyatini, hujayra membranalarining o'tkazuvchanlik darajasini hisobga olish kerak; kriyoprotektorlarning to'g'ri aralashmasini, muzlash paytida haroratning pasayish tezligini va shunga mos ravishda eritish sharoitlarini tanlang.
O'simlik ob'ektlarini kriosaqlash bilan bog'liq texnologiya rivojlanmoqda va doimiy ravishda takomillashtirilmoqda. Shubhasiz, uning kelajagi bor, chunki bugungi kunda kriyosaqlash usuliga asoslangan kriyobanklar selektsionerlarning ishini ancha osonlashtirishi mumkin, bu ularga nav genlari havzasidan, shu jumladan eski naslchilikdan, shuningdek yovvoyi va yo'qolib ketish xavfi ostida bo'lgan o'simlik turlaridan keng foydalanish imkoniyatini beradi.